银杏叶对二乙基亚硝胺诱导的肝癌作用研究

作者:段小娴,苏建家,汪芸

 作者单位：广西医科大学附属肿瘤医院，广西 南宁 530021          【摘要】  　　［目的］ 应用二乙基亚硝胺（DEN）致大鼠肝癌作用的短期体内实验模型，研究银杏叶对DEN致大鼠肝癌作用的影响。［方法］ SPF级雄性Wistar 大鼠，用DEN作为肝癌的启动剂（200μg/kg，ip，只用1次），实验组大鼠从实验一开始即喂食含5% 的银杏叶饲料，对照组则喂食基础饲料, 然后喂食含0.015%的2-乙酰氨基芴（2-AAF）饲料2周,大鼠于停饲2-AAF饲料3天后处死。肝脏取材，做γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）染色，并利用计算机软件计算肝γ-GT阳性灶，计算平均每平方厘米肝面积中γ-GT阳性灶的数目、面积。［结果］ 银杏叶组γ-GT阳性灶的数目、面积分别为1.46±1.02和6.11±4.61，而对照组分别为4.96±0.97和20.21±4.46，统计学显示差异显著。［结论］ 银杏叶具有抵抗DEN对大鼠的毒性作用，并能抑制DEN诱导的大鼠肝癌前病变。

   【关键词】  银杏叶　二乙基亚硝胺　原发性肝癌

　　Impact of Ginkogo Biloba Leaves on the Diethylnitrosamine-induced Liver Cancer

    DUAN Xiao-xian, SU Jian-jia, WANG Yun, et al.

    (Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

    Abstract: ［Purpose］ To study the impact of Ginkogo biloba leaves on the diethylnitrosamine-induced liver cancer using model of murine liver cancer model short-term in vivo. ［Methods］ Male Winstar rats SPF grade were administered with liver cancer initiator diethylnitrosamine (DEN) (200 μg/kg, ip, once only). At the beginning of this experiment, animal food containing 5% Ginkogo biloba leaves was given to trail rats, normal food to the control rats, then murine food containing 0.015% 2-Acetaminofluerene (2-AAF) for 2 weeks to all rats. Rats were killed on third day after feeding of 2-AAF-contained food. Tissue specimens of liver were subjected to γ-glutamyltranspeptidase (γ-GT) staining. The numbers and areas of γ-GT positive foci per square centimeter of the liver area were calculated with a software. ［Results］ The numbers and areas of γ-GT positive foci were 1.46±1.02 and 6.11±4.61 respectively in experimental rats, 4.96±0.97, 20.21±4.46 respectively in control rats, with significant differences. ［Conclusion］ Ginkogo biloba leaves have activity in protecting rats from toxicity of DEN and inhibiting DEN-induced precancerous lesion of liver cancer.

    Key words：Ginkogo biloba; DEN; hepatic neoplasms

    银杏为银杏科植物(Ginkogo biloba L) ，其叶和果有重要药用价值，银杏提取物主要有效成分为黄酮类和萜类内酯化合物。国内外学者对银杏的化学成分、药理作用进行了广泛的研究，证实其对心脑血管及多种疾病有确切治疗作用。银杏叶抗肿瘤作用目前有少许报道，有学者用小鼠移植性肿瘤模型对肝癌实体型Heps、肉瘤S180、艾氏癌实体型EC、艾氏腹水癌EAC进行了研究，认为银杏叶聚戊烯醇等对Heps、S180、EC均有良好的抗癌作用 [1]。

    为进一步证实银杏叶的抗肝癌作用，我们利用广西医科大学附属肿瘤医院病理研究室于20世纪80年代建立的并经国家鉴定认为灵敏、可靠的大鼠短期体内实验模型，对银杏叶进行抑制肝癌作用研究。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    雄性SPF级Wistar大鼠（北京维通利华公司），6周龄，体重 120±10g，二乙基亚硝胺（DEN） 为天津化工厂生产的液体纯品，浓度为99%；2-乙酰氨基芴（2-AAF）为美国Sigma化学公司产品（含量95%~97%，批号：53-96-3）；银杏叶为广西兴安产；基础饲料购自广西医科大学医学实验动物中心；实验饲料是在基础饲料中加入5%的银杏叶粉配制而成。

    1.2 方 法

    1.2.1 动物分组

    将动物随机分为2组，即实验组：银杏叶组；对照组：DEN组。每鼠一笼，饲料和自来水（自动供水系统供给）任动物自由饮食。动物室温度控制在（24±1）℃，相对湿度为40%~70%。

    1.2.2 实验程序

    实验采用本室建立的短期动物实验模型。其程序为：6周龄大鼠进实验室后先饲养观察1周后开始实验，实验开始后，实验组喂食含5%的银杏叶饲料，对照组喂食基础饲料，第7d所有动物腹腔注射DEN 1剂（200mg/kg·bw），同时实验组继续喂饲实验饲料3周，而对照组则继续喂基础饲料。接着所有动物均喂含0.015%的2-AAF饲料2周，并于喂饲此饲料的第7d在乙醚麻醉下行肝大部分切除术作为促癌程序。动物于停2-AAF饲料后换食基础饲料2d，再禁食1d后断颈处死。

    1.2.3 组织处理

    在动物肝脏的特定部位取5块组织，用4℃丙酮—酒精（v:v=1:1）固定24h，脱水、透明后用低温石蜡浸蜡及包埋。切片用改良的Rutenberg法作γ-谷氨酰基转移酶（γ-GT）染色及HE染色。

    1.2.4 切片的观察及统计学处理

    将切片在放大机下放大14倍，在复印纸上画出每张切片图像的大小及其中每个γ-GT阳性灶的大小。用扫描仪将画出的每张图形扫入计算机，然后用自己设计的程序计算出各组每平方厘米肝切面γ-GT灶数（个/ cm2）、灶的总面积（ mm2/cm2）。数据采用SPSS 10.0方差分析方法进行统计。

    2 结 果

    2.1 肝脏的病理变化

    对照组大鼠的肝脏表面及切面均可见密布的灰白色病灶，直径多为1mm~2mm，略隆起；实验组的病灶数均少于对照组，但灶的大小与对照组相差不多。镜下可见，两组动物都可见到散在的肝细胞增生灶及增生结节，大小及多少不等，以对照组为多。卵圆细胞增生程度不一，实验组较轻，大多数限于汇管区，而对照组卵圆细胞增生严重，呈条索状围绕在肝小叶周围，或向肝小叶内增生浸润。

 2.2 γ-GT阳性灶统计结果

    γ-GT染色切片可见肝组织中散在γ-GT阳性灶，呈类圆形、棕红色、界限清楚，与周围淡黄色的阴性背景形成鲜明的对比。部分灶周围肝细胞有明显的被压迫现象。

    γ-GT阳性灶统计结果如表1所示。从表1可以看出：5%银杏叶组中γ-GT阳性灶的总面积（mm2/cm2）和每张切片中γ-GT阳性灶的个数（个/cm2）均显著少于对照组（P=0.000）。

    2.3 两组动物的体重变化

    从表2可以看出，在整个实验期间，两组大鼠的体重增长虽没有统计学意义，但银杏叶组大鼠的体重增长均比对照组增长的快；银杏叶组大鼠肝重体重比也较对照组大。说明银杏叶具有抵抗DEN对大鼠的毒性作用。

    3 讨 论

    早在20 世纪60 年代, 国内外学者便开始将银杏叶总黄酮( FG) 用于扩血管活性研究, 并将其初步应用于临床获得了较好疗效。有大量的研究证实，FG 不但具有扩血管作用，而且还具有降血脂、抗凝血、清除自由基、抗白血病、抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗辐射等作用[1~5]。有研究报道，银杏叶除黄酮类具有抗肿瘤作用外，聚类戊烯醇（GP-1）、银杏叶多糖（GBLP）也有抗肝癌作用[5~7]。高凌等用GP-1 对移植性小鼠肝癌Heps 的抑制作用进行了研究，用GP-1灌胃给药，对移植性小鼠肝癌Heps 的抑瘤率为43.03%～62.51%，认为GP-1对Heps 有良好的抑制作用。还有研究认为，银杏叶提取物对肝脏的纤维化具有保护作用[8]。

    黄曲霉毒素（AFB1）和DEN被公认为自然界的强致癌物。本研究应用DEN致大鼠肝癌作用的短期体内实验模型，研究银杏叶对DEN致肝癌癌前病变作用的影响，发现肝细胞增生性病变及卵圆细胞增生，实验组明显轻于对照组；在整个实验过程中，实验组大鼠的体重增长及肝脏体重比均高于对照组，显示银杏叶有抵抗DEN毒性的作用。

    在肝脏，γ-GT阳性细胞灶被认为是肝细胞癌癌前病变[9]，这些病变的发生和发展与其后发生肝细胞癌有密切的关系，因而被广泛用作研究化学致癌物诱发肝癌形成的指标。本研究就是利用γ-GT阳性灶作为DEN致肝癌作用的观察指标。在本实验中，DEN是肝癌发动剂，启动肝细胞的癌变过程，2-AAF+肝大部分切除是促癌程序，使被DEN启动了的肝细胞迅速增生成可计数的癌前γ-GT灶。结果显示，进食5%银杏叶的实验组大鼠中γ-GT阳性灶的数目、面积都显著少于对照组。提示银杏叶对肝癌前病变有明显的抑制作用，这可能是由于银杏叶中所含的黄酮类、聚类戊烯醇及银杏叶多糖等可以杀死肿瘤细胞，而且可以清除四氯化碳形成的氧自由基，保护单位膜，降低血管阻力，改善肝血流，减轻肝细胞变性、坏死程度，因此也改善了肝功能，在不同环节阻断胶原纤维的形成，使肝脏的纤维化减少，从而降低了肝癌的发生率。

    因此，对银杏叶中的抗癌物质进行深入研究，以期开发出具有保肝、护肝作用，效果好、毒性低，并具有抗肿瘤作用的药物。

【参考文献】  [1] 高凌, 亢寿海, 张琴芬, 等. 银杏叶聚戊烯醇抗癌作用的初步研究[J].江苏药学与临床研究,2003，11（1）：1-3.

[2] 耿秀芳, 孙晓丽, 王洪刚,等. 银杏叶总黄酮降压作用的实验与临床研究[J]. 中国中药杂志,2002,27(8):606-608.

[3] 戴伟，陈学智，王小莉, 等. 银杏提取物及银杏黄酮调节大鼠血脂的效果研究[J]. 上海预防医学杂志, 2003 ,15 (6) :262-265.

[4] Chang WC, Sei CK, Soon S, et al. Antioxidant activity and free radical scavenging capacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay-guided comparison[J]. Plant Science ,2002 ,163(8):1161-1167.

[5] Motwani M, Li X, Schwartz GK. Flavopiridol, a cyclin-2 dependent kinase inhibitor, prevents spindle inhibitor induced endoreduplication in human cancer cells[J]. Clin Cancer Res,2000, 6(3):924-928.

[6] 高凌, 亢寿海, 张能芳, 等. 银杏叶聚戊烯醇对移植性肝癌的治疗作用[J].中医药学刊,2004，22（1）：73-74.

[7] 陈群, 刘天骄. 银杏叶多糖的抗肿瘤和免疫调节作用[J].中药药理与临床，2003,19(5)：18-19.

[8] 钟树志, 刘锡玖. 丹参、银杏叶提取物合用对实验性肝纤维化的保护作用[J]. 肝脏，2005,10（2）：146-147.

[9] Farber E. The sequential analysis of liver cancer induction biochem[J]. Et Biophys Acta, 1980, 605:149-154.