FHIT基因 5′CpG岛甲基化及其与结直肠癌的关系

作者:刘莲叶,段晓明,胡义奎

作者单位：1.南华大学，湖南 衡阳 421001；2.衡阳市中心医院，湖南 衡阳 421001； 3.南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001            【摘要】  　　［目的］探讨结直肠癌FHIT基因甲基化及去甲基化试剂5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对HCT1116细胞生长的影响。［方法］ 用甲基化特异性PCR（MSP）检测4个结肠癌细胞株、30例结直肠癌患者的原发肿瘤组织及其对应的正常组织的FHIT基因甲基化状态，用流式细胞术、HE染色及免疫细胞化学检测5-Aza-CdR对HCT1116细胞生长的影响。［结果］ 4 个结肠癌细胞株中有3个细胞株(75%)存在FHIT基因5′CpG岛的甲基化，30例原发肿瘤组织有14例(46.7%)检出FHIT基因5′CpG岛的甲基化；用5-Aza-CdR处理 HCT1116细胞后，其凋亡率由用药前的1.49％增加到32.6％。［结论］ FHIT基因的5′CpG岛甲基化与结直肠癌的发生发展可能密切相关，5-Aza-CdR可能通过诱导细胞凋亡而抑制HCT1116细胞生长。

    【关键词】  FHIT基因　甲基化　结直肠肿瘤　5-氮-2′-脱氧胞苷

　　结直肠癌的发生是一个多因素多步骤的过程。有研究表明结直肠癌组织中存在脆性组氨酸三联体（FHIT）基因蛋白质的表达缺失[1]，提示抑癌基因FHIT与结直肠癌的发生密切相关。且有作者认为位于FHIT基因5′启动子区域CpG岛的甲基化与FHIT基因的表达缺失有关[2~4]，提示FHIT基因5′CpG岛甲基化为该基因失活的机制之一。本文旨在研究FHIT基因甲基化与结直肠癌的关系，及应用去甲基化试剂5-氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxy cytine，5-Aza-CdR）处理结肠癌细胞HCT1116后，观察HCT1116细胞生长的变化，进一步明确FHIT基因5′CpG岛甲基化与结直肠癌的关系以及探索结直肠癌早期诊断、治疗的新思路。

    1 材料与方法

    1．1 材 料

    1.1.1 主要试剂

    RPMI1640培养基、小牛血清、临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物公司）、CpGnome DNA Modifiction Kit（chemicon）、TaKaRa TaqTM Hot Start Version(大连宝生物)、SssⅠ甲基化酶（New England BioLabs）、5-Aza-CdR（Sigma）、所有引物均由大连宝生物公司合成。免疫细胞化学S-P超敏试剂盒（福州迈新）。

    1.1.2 肿瘤组织标本和细胞培养

    组织标本来自南华大学附属第一医院及衡阳市中心医院2004年8月至2005年5月结直肠癌手术患者30例，年龄17 岁～73岁，其中男性21例，女性 9例；结肠癌患者14 例，直肠癌患者16 例；肿瘤分化程度：高分化11 例，中分化12 例，低分化7 例；病理分期（Dukes分期法）：A期8 例，B期9 例，C期10 例，D期 13例。

    人结肠癌细胞株HT-29、SW480、HCT1116、HRT-18由南华大学肿瘤研究所惠赠。用含10％小牛血清RPMI1640培养基、37℃、5％CO2培养。

    1.2 方 法

    1.2.1 甲基化特异性PCR

    用Herman等[5]描述的MSP来检测FHIT基因的甲基化状态。用亚硫酸氢盐修饰基因组DNA，使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶则不变。然后针对甲基化和非甲基化的等位基因分别设计其各自特异性的引物，用这两对引物对同一DNA模板分别进行PCR扩增来检测基因的甲基化及非甲基化状态。如果应用甲基化特异性引物使基因片段扩增，提示该基因片段发生了甲基化；若应用非甲基化特异性引物使基因片段扩增，则提示该基因片段无甲基化。如果两对引物都可以使DNA片段扩增，说明该基因片段有部分甲基化。

    基因组DNA提取：收集组织及细胞应用临床样品基因组DNA小量抽提试剂盒（上海生工生物公司）提取基因组DNA，保存于－20℃备用。

    基因组DNA亚硫酸氢盐修饰：取1μg基因组DNA按照CpGnome DNA Modifiction Kit（chemicon）操作步骤进行，保存于－20℃备用。

    PCR：FHIT基因引物序列参阅文献[6]（表1），扩增产物为74bp。反应总体积为50μl，包括经亚硫酸氢盐修饰后的基因组DNA约50ng，1.25U DNA聚合酶(TaKaRa Taq HS)，10×PCR 缓冲液(已加入Mg2+)，dNTP (各2.5mM )，引物（终浓度为0.2μmol/L）。反应条件为94℃预热5min，然后于94℃30s，64℃30s，72℃30s共34个循环，最后于72℃延伸5min。正常人外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化序列的阳性对照，经过SssⅠ甲基化酶（New England BioLabs）处理的正常人淋巴细胞DNA作为甲基化序列的阳性对照。水作为空白对照。

    凝胶成像分析系统观察：取6μl PCR产物于3％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察，并拍照。

    1.2.2 5-Aza-CdR处理

    取约3×105个HCT1116细胞，置入100ml培养瓶中用去甲基化试剂5-Aza-CdR处理，浓度分别为1μmol/L 、3μmol/L、5μmol/L，每天更换培养液，共处理3d。对照组不用药物处理。

    1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率

    对数生长期的细胞按上述浓度及对照组分别处理细胞，3d后收集培养细胞，以PBS洗涤、计数，调整细胞浓度为1×106/ml，70%冷乙醇4℃固定24h。用流式细胞仪进行细胞周期分析及细胞凋亡率检测。

    1.2.4 HE染色

    做好细胞爬片，收集经不同浓度5-Aza-CdR处理的HCT1116细胞及未经5-Aza-CdR处理的HCT1116细胞，PBS冲洗2次，乙醇固定，苏木素染色，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察细胞形态、大小。

    1.2.5 免疫细胞化学

    做好细胞爬片，收集经不同浓度5-Aza-CdR处理的HCT1116细胞及未经5-Aza-CdR处理的HCT1116细胞，PBS冲洗2次，乙醇固定，按免疫细胞化学S-P超敏试剂盒（福州迈新）说明操作，一抗FHIT浓度为1:100， DAB显色，显微镜观察，以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。

    1.2.6 统计学分析

    两组间均数比较用t检验，两样本率的比较用四格表资料的Fisher确切概率法，以P＜0.05为差异具有显著性意义。

  2 结 果

    2．1 MSP检测结直肠癌组织及结肠癌细胞株FHIT基因甲基化状态

    我们检测了30例结直肠癌组织及其对应的正常组织，发现结直肠癌组织的FHIT基因甲基化率为46.7%，肿瘤对应的正常组织甲基化率为20%。

    4个结肠癌细胞株除SW480细胞的FHIT基因未甲基化外，其余3个细胞株均检测出FHIT基因部分甲基化，结肠癌细胞株中FHIT基因甲基化率达到75％。同时我们对结直肠癌组织的FHIT基因甲基化阳性率与病人的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度及病理分期作了统计学分析，未发现FHIT基因甲基化率与以上各因素有明显的关系（表2）。

    2．2 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率

    我们未发现5-Aza-CdR对HCT1116细胞的生长周期有明显影响，但是发现该药对细胞凋亡率有明显的影响，细胞凋亡率分别为：用药前为1.49%；1μmo/L 5-Aza-CdR处理后为15.1%；3μmo/L 5-Aza-CdR处理后为29.4%；5μmo/L 5-Aza-CdR处理后为32.6%。可见，细胞凋亡率随着药物浓度的增加而增加（图1）。

    2．3 免疫细胞化学

    用药前HCT1116细胞浆有很弱的棕黄色颗粒，用5-Aza-CdR处理后，细胞浆有明显的棕黄色颗粒出现，提示用药前HCT1116细胞有很弱的FHIT基因蛋白质表达，用5-Aza-CdR处理后，HCT1116细胞的FHIT基因蛋白质表达增强。

    2.4 HE染色

    HE染色可见用药前的HCT1116细胞核很大，核仁明显，细胞形状不规则；用5-Aza-CdR处理后HCT1116细胞变小，细胞核浓缩，并有凋亡细胞出现，随着药物浓度的增加，细胞数目减少，且细胞由不规则形状变为梭形，凋亡细胞增多(图2)。

    3 讨 论

    我们研究了结肠癌细胞株、结直肠癌组织及其对应的正常组织FHIT基因5′CpG岛的甲基化状态，以及去甲基化试剂5-Aza-CdR对HCT1116细胞生长的影响，同时分析了FHIT基因甲基化与临床病理的关系，发现结直肠癌组织及结肠癌细胞株均存在高比例的FHIT基因甲基化。应用不同浓度的5-Aza-CdR处理HCT1116细胞，发现用5-Aza-CdR处理后HCT1116细胞的凋亡率由用药前的1.49％上升到32.6％，且细胞凋亡率随着药物浓度的增加而增加；药物处理后FHIT基因蛋白质的表达增强；而且用5-Aza-CdR处理后，HCT1116细胞变小，细胞由不规则形状变为梭形，细胞核浓缩，并有凋亡细胞出现，提示5-Aza-CdR有诱导HCT1116细胞凋亡的作用，而且可以使甲基化的FHIT基因逆转，使因甲基化而失活的FHIT基因的蛋白质重新表达，提示5-Aza-CdR在临床治疗肿瘤方面有潜在的应用前景；进一步证实了结肠癌存在FHIT基因的甲基化，FHIT基因的甲基化为该抑癌基因失活的机制之一。

    我们发现肿瘤细胞株较肿瘤组织存在较高比例的FHIT基因甲基化，Zochbauer等[6]亦发现肺癌和乳腺癌细胞株存在较肿瘤组织较高的FHIT基因甲基化比例，可能因为肿瘤细胞在培养过程中发生了转变或者肿瘤细胞来自更加恶性的肿瘤。另一方面，在肿瘤对应的正常组织中，我们也发现较高比例的FHIT基因甲基化，该结果与Kuroki等[7]在食管癌的FHIT基因甲基化研究一致，肿瘤对应的正常组织FHIT基因甲基化的出现可能代表了癌前期病变的出现，提示用MSP检测FHIT基因甲基化可能成为一个潜在的肿瘤分子生物学诊断指标。同时我们对结直肠癌组织的FHIT基因甲基化阳性率与病人的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度及病理分期进行统计学分析，没有发现FHIT基因甲基化率与以上各因素有明显的关系，该结果与Zochbauer等[6]研究结果一致。

    甲基化在真核细胞基因表达调控中起着重要的作用，肿瘤细胞中存在着DNA异常甲基化。 DNA甲基化是一种发生在CpG二核苷酸上对胞嘧啶的共价修饰，由S-腺苷蛋氨酸提供甲基，在细胞内DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）催化作用下，于DNA复制后形成5-甲基胞嘧啶的反应[8]。DNA甲基化的主要特征是广泛癌基因低甲基化和部分区域抑癌基因高甲基化共存，抑癌基因启动子区域的高甲基化引起其转录抑制，进一步导致抑癌基因失活，从而推测DNA甲基化参与肿瘤的发生发展[9,10]。由于甲基化的过程是可逆的，所以针对DNA甲基化治疗肿瘤的可能性是明确的[11]。Robert等[12]研究发现肿瘤细胞中抑癌基因的异常甲基化引起基因表达失活，与肿瘤细胞DNMT1 mRNA高表达有关，提示DNMT1活性高低是影响DNA甲基化的一个重要因素，抑制DNMT1的活性可以改变DAN甲基化状态，如果降低DNMT1 mRNA表达对改变DNA高甲基化状态和恢复抑癌基因表达成为可能。

    5-Aza-CdR的主要作用机制表现在以下几个方面：与DNMT共价结合降低其活性[12]；通过诱导细胞凋亡、细胞毒作用[13]、影响细胞周期[14]抑制肿瘤细胞生长；诱导肿瘤/睾丸抗原及肿瘤相关抗原[15]。5-Aza-CdR可以使多种因甲基化而失活的抑癌基因重新表达，恢复抑癌基因的功能，抑制肿瘤细胞的生长而达到治疗肿瘤的目的。

    恶性肿瘤中抑癌基因CpG岛异常的甲基化可以导致其失活，5-Aza-CdR 作为一种甲基化抑制剂，不仅可以重新激活多种抑癌基因使其功能恢复，重新发挥抗肿瘤的作用，而且可以诱导凋亡，抑制肿瘤细胞的生长，因而可能有其广阔的临床应用前景。目前已应用于血液系统疫病的临床治疗。但是由于DNA甲基化做为一种正常的基因调控方式，5-Aza-CdR对基因的去甲基化作用缺乏特异性，它在治疗异常甲基化的同时，可能会引起处于抑制状态的某些基因恢复活性，导致正常的基因调控机制的紊乱。所以5-Aza-CdR广泛应用于临床还需要一定的探索。

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