HuR蛋白在胃癌组织中的表达及其意义

　　作者：胡跃云,吴宏菊,辛彦,赵晶　　作者单位：沈阳，中国医科大学第一医院肿瘤研究所第四研究室 普通外科研究所肿瘤病理研究室

　　【摘要】目的检测HuR蛋白在正常胃黏膜、癌前病变及胃癌中的表达，分析并探讨其与胃癌临床病理因素的关系及意义。方法　采用组织芯片和免疫组化PV-9000二步法检测HuR在235例胃癌及其癌前病变和部分配对正常胃黏膜在上述组织中的表达。结果　HuR在胃癌组织、肠上皮化生和异型增生中的表达(分别为43.83%、40.00%和40.74%)均显著高于正常胃黏膜(1.60%)，均P<0.001;胃癌中HuR表达与组织分化程度、Lauren分型、Borrmann分型有关(P<0.05)。结论　HuR在胃癌胞质中高表达可能参与了胃癌的发生发展过程，为胃癌形成的早期事件之一;有望用于胃癌的诊断和治疗。

　　【关键词】 胃肿瘤;　免疫组织化学;　类胚胎致死异常视觉基因1

　　【Abstract】　Objective　To detect expression of HuR in normal gastric mucosa，gastric carcinoma and precancerosis，to investigate its influence on the factors of clinicopathologic variables.Methods　Tissue microarrays containing 235 cases of tumor specimens were constructed.HuR expression were investigated by immunohistochemical studies.Results　The expressions rates of HuR in cancer，intestinal metaplasia，dysplasia were 43.83%,40.00% and 40.74%，respectively，which were over the expression of HuR in normal gastric mucosa(1.60%)(P<0.001).Over expression of HuR protein was associated with many complex clinicopathologic factors such as histological differentiation and Lauren type(P<0.05).Conclusions　Cytoplasmic high-expressed HuR immunoreactivity possibly participated the procession of the carcinogenesis，growth and prognosis of gastric carcinoma，which plays a very important role in the early stage and be regarded as the target for diagnosis and therapy.

　　【Key words】　Stomach neoplasms;　Immunohistochemistry;　ELAVL1(HuR)

　　胃癌是我国最常见的肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的首位[1]。胃癌患者在早期症状不明显，确诊时大多已进入中晚期，一般外科手术预后不良。胃癌的内科化疗尚未建立标准方案，因此对于胃癌早期诊断和癌变分子机制的研究显得尤为重要。HuR是Hu家族中至今唯一在人组织中除神经组织外广泛表达的蛋白。Hu家族因与果蝇体内的胚胎致死性异常视觉蛋白同源，所以又被称为类胚胎致死异常视觉(ELAVL)家族，而HuR又名ELAVL1。HuR是被公认为数不多的mRNA结合蛋白，可以与COX-2、cyclin A、MMP-9、VEGF、p53等mRNA结合增强其蛋白表达[2-6]，从而对肿瘤的增殖分化、细胞凋亡、侵袭转移、血管新生和免疫逃避发挥广泛作用。本研究通过检测HuR在胃癌与正常胃黏膜中的表达，探讨HuR胞质表达在胃癌、癌前病变与正常胃黏膜中的差异，及其与胃癌各临床病理因素和预后之间的关系及意义。

　　对象与方法

　　1. 研究对象：收集中国医科大学附属第一医院肿瘤外科手术切除胃癌标本235例及距癌灶边缘>5 cm处正常胃黏膜188例，慢性萎缩性胃炎37例，肠上皮化生85例，异型增生27例。其中男164例，女71例，年龄30～80岁，中位年龄55岁;管状腺癌199例(高分化腺癌13例，中分化腺癌68例，低分化腺癌118例)，乳头状腺癌3例，未分化癌4例，印戒细胞癌9例，黏液腺癌20例;Borrmann分型：Ⅰ型11例，Ⅱ型35例，Ⅲ型175例，Ⅳ型14例;有淋巴结转移173例，无淋巴结转移62例。

　　2. 组织芯片构建：采用组织芯片制作仪(Microarrayer，Beecher Instruments，USA)将235例及其配对正常胃黏膜构建在7张组织芯片上。

　　3. 试剂与方法：采用PV-9000免疫组化二步法，鼠抗人HuR单克隆抗体、PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒和氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。严格按照试剂盒推荐的方法进行实验，用PBS代替一抗作阴性对照。

　　4. 结果判定：HuR蛋白在细胞质呈现清晰棕黄色颗粒的特异性免疫反应为阳性反应(在生理状态下HuR蛋白在正常胃黏膜、间质细胞、胃癌胞核均有表达，本研究未计数在胞核中的表达情况;本文中HuR在不同组织中的表达均指在胞质中的表达情况)。由两位观察者采用盲法观察，每个病例随机选择2个高倍视野，计数200个细胞，按照阳性细胞数占同类细胞数的比例进行等级划分。结果采用半定量计分方法，根据细胞染色强度(A)和染色细胞所占的比例(B)乘积(A×B)来判定。A：无特异染色=0、轻度染色(淡黄)=1、中度染色(棕黄)=2、强染色(深棕黄)=3;B：阳性细胞数<5%计为0分、5%～25%计为1分、26%～50%计为2分、51%～75%计为3分、>75%计为4分。A×B：0分为阴性(-)、1～4分为弱阳性(+)、5～8分为中度阳性(++)、9～12分为强阳性(+++)。因HuR蛋白在胃癌中免疫反应较强，遂将中强度阳性[(++)～(+++)]归为高表达组，将阴性与弱阳性[(-)～(+)]归为低表达组，高表达组用所占总数比例表示阳性表达率。

　　5. 统计学处理：所有数据均采用SPSS for windows 16.0统计学系统软件处理，HuR表达及其与胃癌的临床病理因素的分析采用行×列表的χ2检验。P <0.05为差异有统计学意义。

　　结　　果

　　1. HuR在正常胃黏膜、胃癌及其癌前病变中的表达(表1，图1)：HuR蛋白在胃癌中的表达(43.83%)显著高于远癌正常胃黏膜的表达(1.60%)，χ2=99.203，P<0.001。在肠上皮化生和异型增生中HuR蛋白表达率分别为40.00%和40.74%，均显著高于正常胃黏膜(χ2=73.686、59.428，均P<0.001)，两者与胃癌表达相比，未见统计学意义(χ2=0.374、0.094，P=0.541、0.759)。在慢性萎缩性胃炎中的表达与正常胃黏膜和胃癌分别比较，差异均有统计学意义(χ2=17.210、6.617，均P<0.05)。HuR蛋白在正常胃体腺胞质中多为阳性表达(++)，本文未计数，在胃窦腺胞质中多为阴性表达。

　　2. HuR的表达与胃癌临床病理因素的关系(表2，图1)：胃癌中HuR蛋白表达与细胞分化程度、Lauren分型相关，其中高中分化组(51.85%)与低分化组(33.05%)比较，差异有统计学意义(P<0.05);肠型胃癌(51.19%)与弥漫型胃癌(35.11%)比较，差异也有统计学意义(P<0.05)。　　表1　HuR在正常胃黏膜、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生及胃癌中的表达情况　表2　HuR蛋白表达与胃癌各临床病理因素

　　讨　　论

　　HuR是一种重要的mRNA结合蛋白家族Hu家族成员之一，Hu家族是脑脊髓炎副癌综合征在血清中出现抗体的总称。Hu家族有4个成员：HuB(Hel-N1)、HuC、HuD和HuR，前三个成员主要在终端分化的神经组织表达并与神经发育有关，而HuR是一种广谱mRNA结合蛋白，在许多组织细胞中广泛表达。HuR是连接于3′非翻译保守区(3′UTR)含有AREs(富含A/U或AU序列)的短寿命mRNA，AREs可通过自体直接脱腺苷化作为基因表达的抑制因素，促使mRNA快速衰变降解。而HuR能延缓mRNA半衰期，抑制其降解，从而增强其转录后翻译能力。在生理状态下，HuR主要定位在细胞核，功能是与靶基因的mRNA结合形成复合物，穿梭到胞质，在此过程中HuR保护mRNA避免衰变降解[6-9];在病理状态下，HuR在胞质表达增加，阻止含AREs靶基因脱腺苷化降解过程，延长mRNA的寿命，使其蛋白产物异常增加。本研究只针对HuR在胞质的表达进行分析探讨。近年来研究发现，HuR在肿瘤细胞胞质表达水平升高，机制是与富含AREs的肿瘤细胞增殖相关的基因mRNA结合，减少其降解率，延缓其半衰期，从而加强靶因子的翻译表达，继而对肿瘤的增殖分化、细胞凋亡、侵袭转移、血管新生和免疫逃避发挥广泛作用，并且HuR目前研究已经证实HuR参与多种肿瘤的生成，如乳腺癌、肠癌、宫颈癌、肝癌等[8,11,13-14]。Kang等[7]发现与正常胃黏膜相比，HuR蛋白在胃癌中表达显著升高，主要定位在胞质，在进展期胃癌中的表达显著高于早期胃癌。本研究发现，从正常胃黏膜→慢性萎缩性胃炎→肠化生→异型增生→胃癌，阳性表达率逐渐升高，正常胃黏膜组与肠化生、异型增生、胃癌组分别比较均有统计学意义(P<0.001);慢性萎缩性胃炎组与肠化生、异型增生、胃癌组分别比较均有统计学意义(P<0.05);慢性萎缩性胃炎与正常胃黏膜比较差异有统计学意义(P<0.001)，提示HuR在胃癌的发生发展中起一定的促进作用，HuR可能作为致癌因子参与胃癌癌变过程。本研究中，HuR表达与WHO分型及Lauren分型相关，高中分化组胃癌的表达显著高于低分化组，肠型胃癌组显著高于弥漫型胃癌组(P<0.05)，与Mrena等[2]运用216例胃癌采用同样实验方法研究发现HuR胞质表达与肠型胃癌有关相一致;此外在有无淋巴结转移的结果两研究结果一致，都为HuR表达与淋巴结转移无关，提示HuR可能是参与胃癌的早期事件之一，为进一步阐明HuR导致胃癌发生机制提供了有力证据。Mrena等[3]又对325例胃癌中HuR与cycline A的免疫组化结果进行了分析研究，发现在HuR胞质阳性表达的病例中cycline A极少出现阴性表达，说明两者存在相关性，提示HuR通过对细胞周期的调控来促进胃癌生成。Wang等[15]也在肠癌细胞培养中证实HuR表达减少时出现cycline A蛋白生成的下降。

　　综上所述，作为公认的mRNA结合蛋白，HuR可能参与胃癌发生发展的过程，可能是增强作用于COX-2、cycline A、VEGF等mRNA的翻译能力从而加速致癌过程，运用实验技术阻遏HuR胞质转移或者直接抑制HuR活性可能抑制胃癌发生，从而为指导临床分子靶向治疗提供新思路。

　　(本文图片见光盘)

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