RhoC、MMP-9的过表达促进胃癌的浸润转移

　　作者：孙玉清,刘秀哲,刘,岩,朱艳丽　　作者单位：佳木斯大学，黑龙江 佳木斯

　　【关键词】 胃癌;RhoC;MMP-9;浸润转移;免疫组化

　　胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，我国卫生部组织的1990～1992年全国第二次死因调查中，胃癌的粗死亡率为25.2/10万，占所有因癌症死亡人数的23.2%。手术为现在公认的最有效的治疗手段，但术后5年生存率仅为55%左右，众多研究表明，肿瘤的侵袭和转移是胃癌恶性特征和标志，也是导致胃癌患者治疗失败的主要原因及治愈率得不到提高的主要影响因素。研究表明，侵袭和转移由肿瘤细胞的多种生物学行为所决定，而肿瘤细胞的运动能力及对细胞外基质的降解能力是两个重要方面。RhoC为Ras同源类似物C(Ras homology C)，它参与了肿瘤发生发展的几乎每个环节，包括调节细胞骨架和细胞周期、改变细胞黏附和细胞运动、影响细胞转化、调节细胞外基质的降解等生物学行为[1～4]。基质金属蛋白酶MMP-9是一种蛋白水解酶，其主要功能是降解破坏细胞外基质成分[5]，在肿瘤浸润转移中起重要作用。二者在胃癌组织中的表达变化与胃癌细胞增殖能力及浸润转移的关系尚少见报道。本文采用S-P免疫组化技术，观察62例原发性胃癌中RhoC和MMP-9表达变化，探讨二者在胃癌浸润、淋巴结转移中的作用及相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　选取佳木斯大学附属第一医院1997～2007年间手术切除且资料完整的原发性胃癌54例。所有患者术前未经放疗和化疗。其中男30例，女24例;年龄26～83岁，平均54岁;肿瘤大小：≤5cm34例，>5cm20例;肿瘤部位：上段及中段21例，下段33例;肿瘤分化：高、中分化41例，低分化13例;侵及浆膜及浆膜以外者19例，未及浆膜者35例; 有淋巴结转移23例，未见淋巴结转移31例。

　　1.2 方法

　　新鲜标本常规福尔马林固定，24h内取材，石蜡包埋，连续4μm厚度切片，HE染色。免疫组化染色：采用链酶菌素-生物素(S-P)免疫组化技术，RhoC和MMP-9单克隆抗体(即用型)及S-P免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，操作严格按说明书进行。用已知阳性片作阳性对照，同时用PBS替代第一抗体作阴性对照。

　　1.3 结果判断

　　两位病理医师独立观察每张切片10个具有代表性的高倍视野。 RhoC和MMP-9阳性判断标准：阳性染色者在细胞膜或(和)浆有棕黄色颗粒沉着。根据肿瘤细胞膜或浆的染色程度以及染色细胞百分率进行分析评分：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。着色细胞占计数细胞百分率0～10%为0分，11%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，≥75%为4分。两者相加为最终免疫组化结果：0～1分为阴性，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。

　　1.4 统计学处理

　　所得半定量资料用χ2检验，两样本率的相关性分析用秩相关分析法。

　　2 结果

　　2.1 RhoC表达与胃癌临床病理学特征的关系

　　54例胃癌组织中，27例RhoC蛋白表达阳性(50.00%);其表达与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤原发部位、原发肿瘤大小无明显相关(P>0.05);但是随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生，其阳性表达率明显升高;其中未侵及浆膜组与侵及浆膜组的RhoC蛋白阳性表达率分别为34.29%(12/35)和78.95%(15/19)，差异显著，有统计学意义(P<0.01);高-中分化组与低分化组RhoC蛋白阳性表达率差异显著，有统计学意义(P<0.01);淋巴结转移组与无淋巴结转移组的RhoC蛋白阳性表达率分别为86.96%(20/23)和22.58%(7/31)，差异显著，有统计学意义(P<0.01)，见表1。表1 RhoC在胃癌组织中的表达情况与临床病理特征的关系

　　2.2 MMP-9表达与胃癌临床病理学特征的关系

　　MMP-9蛋白的阳性表达率随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生而升高(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤的原发部位及肿瘤的大小无明显相关(P>0.05)。本组54例胃癌组织中MMP-9阳性表达者共40例，其中未侵及浆膜组与侵及浆膜组的MMP-9蛋白阳性表达率差异显著，有统计学意义(P<0.05);高-中分化组与低分化组MMP-2蛋白阳性表达率差异显著，有统计学意义(P<0.05);淋巴结转移组与无淋巴结转移组的MMP-9蛋白阳性表达率差异显著，有统计学意义(P<0.05)，见表2。表2 MMP-9在胃癌组织中的表达情况与临床病理特征的关系

　　2.3 胃癌组织中RhoC和MMP-9表达情况与胃癌浸润、转移

　　胃癌组织中RhoC和MMP-9表达呈正相关(rs=0.423,P<0.05),即随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生二者均呈增高趋势，见表3。表3 RhoC与MMP-9在胃癌中表达的相互关系

　　3 讨论

　　本研究应用免疫组化方法观察RhoC和MMP-9在胃癌组织中的表达变化，结果表明，RhoC和MMP-9过表达均与胃癌浸润及淋巴结转移呈正相关，二者在胃癌浸润转移过程中相互关联，共同作用。RhoC作为Rho家族蛋白的重要成员，是Ras的同源类似物，定位于染色体1p21-p13。RhoC基因编码193个氨基酸。是相对分子质量大约为21KD的鸟苷酸(GTP)结合蛋白，具有GTP酶活性[6]。Clark[1]等通过对高转移的黑色素瘤行DNA Array检测，从7070个基因中筛选发现RhoC与肿瘤转移直接相关，从此掀开了RhoC与恶性肿瘤转移关系的研究热潮。Shikada等[7]对49例非小细胞肺癌患者标本进行免疫组织化学的检测，发现无论是鳞癌还是腺癌，癌细胞胞质中都出现RhoC蛋白的较深染色，而在正常肺上皮或肿瘤组织的基质细胞中未能检测到RhoC蛋白的表达，进一步通过Real-time RT-PCR法显示伴有淋巴结浸润肺癌的患者RhoC mRNA水平明显高于无淋巴结浸润者(P<0.01)，同样在伴有血管转移或胸膜转移的非小细胞肺癌中也有类似发现，从而首次提出RhoC mRNA的表达水平与非小细胞肺癌侵袭转移能力呈正相关关系。石铮等[8]采用逆转录-聚合酶链式反应技术(RT- PCR)分析28例胃癌患者的癌组织(GC)及癌旁胃粘膜组织(PGMT)、肝转移癌(ML)组织中RhoC mRNA及蛋白的表达，结果肝转移灶中RhoC mRNA及蛋白表达明显高于胃癌组织中者(P<0.05)，提示RhoC mRNA及蛋白的表达与胃癌的转移有关。本研究发现随浸润深度的加深、分化程度的降低、淋巴结转移的发生，RhoC的表达也随之明显升高。

　　MMP-9是基质金属蛋白酶家族成员之一，可降解细胞外多种基质成分，其中包括基底膜的主要成分-Ⅳ型胶原[5]。破坏基底膜的完整是肿瘤浸润和转移的先决条件。激素、生长因子和细胞因子等可通过多种信号传导途径直接或间接作用于MMPs基因启动区活化蛋白-1位点,调控MMPs的转录率。Torii等认为MMP-9高表达的肿瘤细胞在侵袭、转移过程中突破各种屏障的能力较高[9]。本研究结果显示，MMP-9与胃癌组织的浸润深度、分化程度及淋巴结转移密切相关，差异具有显著性。

　　恶性肿瘤的浸润转移是一个复杂的连续过程, 不少学者提出多基因协同学说,认为在肿瘤发生发展和转移的各个阶段,至少有2个或2个以上功能不同的异常激活的癌基因各自发挥着不同的作用, 并在时间上和空间上相互配合,协同促进了细胞的癌变和转移。本研究用免疫组化半定量研究发现RhoC和MMP-9表达呈正相关，肿瘤细胞的运动能力是肿瘤侵袭的先决条件，是肿瘤转移扩散的关键。细胞运动可以分为四个步骤：细胞伸出层状伪足、其前端与基质形成新的黏附、细胞收缩以及尾端的去黏附。同时释放各种蛋白酶破坏其部分组织，因此细胞运动与基质降解在肿瘤浸润转移中是相互配合、共同作用的。还有实验研究表明RhoC既能明显上调MMPs的表达水平，同时又能增加MMPs的活性，使降解胞外基质能力增强，从而导致肿瘤侵袭活性的增强[4]。综上所述,我们支持多基因协同学说,并认为两者协同作用共同促进胃癌的转移浸润。

　　【参考文献】

　　[1]Clark EA,Golub TR,Lander ES,et al.Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC[J].Nature，2000，406(6795):532535

　　[2]Riento K,Ridley AJ.Rocks:Multifunctional kinases in cell behaviour[J].Nat Rev Mol Ce11 Biol，2003，4(6):446456

　　[3]Ridley AJ,Schwartz MA,Burridge K,et al.Cell migration: integrating signals from front to back[J].Science，2003，302(5651):17041709

　　[4]Ikoma T,kahashi TaT,Nagano S,et al.A definitive role of RhoC in metastasis of orthotopic lung cancer in mice[J].Clin Cancer Res，2004，10(3):11921200

　　[5]Aznavoorian S, Murphy AN.Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis[J].Cancer，1993，71(4):13681383

　　[6]Morris SW,Valentine MB,Kirstein MN,et al.Reassignment of the human ARH9 RAS-related gene to chromosome 1p13-p21[J].Genomics，1993，15(3):677679

　　[7]Shikada Y,Yoshino I,Okamoto T,et al.Higher expression of RhoC is related to invasiveness in non-small cell lung carcinoma[J].Clin Cancer Res，2003，9(14):52825286

　　[8]石铮,郑岩松.RhoC基因及蛋白在胃癌肝转移中的表达及意义[J].中华实验外科杂志，2002，19(4):310311

　　[9]Torii A,Kato T,Uesaka K,et al.Plasma concentration of matrix metalloproteinase 9 in gastric cancer[J].Br J Surg，1997，84(1):133136