LY294002对胃癌细胞SGC7901增殖及相关调控因子的影响

　　作者：许朝,姜藻　　作者单位：东南大学附属中大医院 肿瘤中心,江苏 南京

　　【摘要】目的:研究PI3K抑制剂LY294002对SGC7901胃癌细胞增殖凋亡及相关调控因子的影响。方法：MTT法测定细胞增殖,流式细胞术Annexin VFITC/PI染色法检测细胞凋亡率,RTPCR检测NAG1、Skp2 mRNA的表达情况。结果：LY294002可抑制SGC7901的生长,呈时间剂量依赖性,细胞表现出形态学改变;经10、30、50 μmol·L-1的LY294002作用12 h的凋亡率依次为(12.7±0.42)%、(36.5±0.45)%、(64.1±0.79)%,明显高于空白对照组的(2.3±0.36)%(均P<0.01);LY294002可上调NAG1 mRNA表达,下调Skp2 mRNA表达。结论：LY294002可改变胃癌细胞株SGC7901 Skp2和NAG1基因的表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与其调控NAG1、Skp2 mRNA表达水平有关。

　　【关键词】 胃癌细胞; PI3K; 细胞凋亡; Skp2; NAG1

　　Influence of PI3K inhibitor on the proliferation and related regulatory

　　factors of gastric carcinoma cell SGC7901

　　XU Chao, JIANG Zao(Center of Clinical Oncology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] Objective: To explore the influence of PI3K inhibition by LY294002 on the proliferation and correlated regulatory factors of gastric carcinoma cell SGC7901.Methods： The effect of LY294002 on the proliferation of gastric cancer cell were evaluated by MTT assays.Flow cytometry analysis was used to determine the apoptosis rate. RTPCR was applied to measure the expression of NAG1(Nonsteroidal antiinflammatory drug activated gene1) and Skp2 (Sphase kinase associated protein2)mRNA. Results： Administered with LY294002,the proliferation of gastric cancer cell decreased in dose and timedependent manners.The cell apoptosis rates after the treatment with 10, 30, 50 μmol·L-1 LY294002 for 12 h were(12.7±0.42)%， (36.5±0.45)%， (64.1±0.79)% respectively, which were higher than those in control group(2.3±0.36)%(P<0.01). The expression of Skp2 mRNA was downregulated while that of NAG1 mRNA was upregulated. Conclusion： LY294002 could inhibit proliferation and induce apoptosis of SGC7901 cells, possibly through the regulation of Skp2 and NAG1 expressions.

　　[Key words] gastric carcinoma cell line; PI3K; cell apoptosis; Skp2; NAG1

　　胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一。近年来分子生物学研究表明,胃癌的发生与多种癌基因及抑癌基因的异常有关。PI3K/Akt信号通路是参与细胞生长、增殖、凋亡、分化调节的重要信号转导通路[1-2],在胃癌中异常激活,与胃癌的发生发展密切相关[3]。近来研究发现,S期激酶相关蛋白2(Sphase kinase associated protein2, Skp2)和非甾体抗炎药诱导基因1(Nonsteroidal antiinflammatory drug activated gene1, NAG1)在胃癌中异常表达,参与胃癌细胞的转化进展,但与PI3K/Akt信号通路的异常激活是否存在关联尚未明确。本实验通过PI3K靶向抑制剂LY294002对胃癌细胞SGC7901作用,以明确PI3K/Akt信号通路与NAG1、Skp2的关系及其临床意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　人胃癌细胞系SGC7901由本实验室传代培养,LY294002、胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Sigma公司,胰蛋白酶、DMSO、MTT购自CST公司,RTPCR试剂盒及Annexin VFITC/PI试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司;βactin及NAG1、SKP2基因引物由Invitrogen公司合成,pAkt(Ser473)、AKT抗体购自CST公司;流式细胞仪为美国BD公司FACS Calibur型。

　　1.2 方法

　　1.2.1 LY294002溶液的配置 将LY294002干粉5 mg充分溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液325 μl中,配制成50 mmol·L-1的LY294002溶液,将溶液在-20 ℃冰箱储存,使用前稀释成指定的浓度。

　　1.2.2 细胞培养 将SGC7901细胞加入10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养,每2～3天传代1次。

　　1.2.3 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长活性 取对数生长期的SGC7901细胞,0.25%胰酶消化,配制成1×105 ml的悬液,接种于96孔培养板,每孔100 μl,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育过夜后,实验组分别给予终浓度为10、30、50 μmol·L-1的LY294002,总体积200 μl,另设空白调零组、空白对照组,每组设5个复孔,分别培养4、8、12 h后,每孔分别加入5 g·L-1的MTT 10 μl继续培养4 h后去上清液,再加入DMSO 100 μl,水平震荡10 min。用酶标仪在波长570 nm处测每孔光吸收值(D),重复实验3次。

　　1.2.4 倒置显微镜观察 上述各组细胞于导致显微镜下直接观察细胞形态变化。

　　1.2.5 Annexin VFITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率 收集经10、30、50 μmol·L-1的LY294002作用12 h的细胞和空白对照组细胞,用PBS洗涤2次(1 000 r·min-1离心5 min),弃去上清,加入500 μl Binding Buffer悬浮细胞,再依次加入5 μl Annexin VFITC混匀后,加入5μl PI混匀。避光室温反应20 min,1 h内流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

　　1.2.6 RNA抽提及RTPCR 单层贴壁细胞培养指定的时间后,弃掉培养液,将Trizol试剂直接加在培养细胞上,反复吹打使细胞至充分裂解,将裂解液移入1.5 ml离心管中。室温下静置5 min,4 ℃、12 000×g离心10 min,将上清转移入另一个离心管中。以Trizol∶氯仿为5∶1的比例加入氯仿,用力颠倒离心管以充分混匀,静置10 min使其分层后,4℃、12 000×g离心15 min。转移水相至1.5 ml离心管中,加入等体积异丙醇,振荡混匀,室温放置10 min。4 ℃、12 000×g离心10 min,弃上清。在离心管中加入75%乙醇,振荡片刻,以4 ℃、7 500×g离心5 min,弃上清。室温静置5～15 min使RNA沉淀干燥,以无菌水溶解,保存于-70 ℃冰箱中。然后应用紫外分光光度计测量样品在260 nm的吸光度,确定RNA质量。取4 μl RNA样品、Oligo(dT)1 μl及10 mmol·L-1dNTP与DEPC水混合,置于65 ℃水浴5 min,立即放到冰上。然后依次加入RNase抑制剂、DTT及逆转录酶,37 ℃孵育50 min。最后70 ℃,15 min,终止反应,得到反转录产物cDNA。建立最适的PCR反应体系,扩增相应的产物。引物(由Invitrogen公司合成)如下：NAG1上游引物为5′ACTCCGAAGACTCCAGATTCCGA3′,下游引物为5′ATGCACATGGTCACTTGCACCT3′;Skp2上游引物为5′TGGCCCCAAATTCGTAAA3′,下游引物为5′GCTC

　　AAGCCACAACACTC3′;内参为βactin,上游引物为5′TATGACTTAGTTGCGTTACACC3′,下游引物为5′CCTTCACCGTTCCAGTTT3′。RTPCR产物行琼脂糖凝胶电泳,数字成像系统拍照分析。

　　2 结 果

　　2.1 LY294002对SGC7901细胞的生长抑制效应

　　MTT法检测结果显示,10、30、50μmol·L-1的LY294002对SGC7901细胞有生长抑制作用,呈时间剂量依赖性(表1),各组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。表1 四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率同一浓度LY294002干预不同时间相比较,a P<0.01

　　2.2 倒置显微镜下细胞形态学变化

　　对照组的SGC7901细胞生长良好,细胞呈圆梭状,贴壁生长,核浆比值较大,核与染色质均匀。经LY294002作用12 h后,细胞生长明显受到抑制,可见部分细胞变圆漂浮,部分细胞固缩分解,并出现细胞碎片。

　　2.3 LY294002对SGC7901细胞凋亡率的影响

　　随着LY294002作用浓度的增加,细胞凋亡率也逐渐增加,10、30、50 μmol·L-1 LY294002作用12 h后的细胞凋亡率依次为(12.7±0.42)%、(36.5±0.45)%、(64.1±0.79)%,而对照组为(2.3±0.36)%(图1),各组间差异有统计学意义(P﹤0.01)。A

　　2.4 LY294002对Skp2、NAG1 mRNA表达的影响

　　经10、30、50 μmol·L-1的LY294002作用12 h后,Skp2、NAG1 mRNA的表达水平出现了明显变化(图2)。通过灰度值分析可见：随着药物浓度增加,Skp2 mRNA表达逐渐减少,而NAG1 mRNA表达呈增高趋势(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　LY294002是PI3K的特异性抑制剂,其脂溶性强,易通过胞膜,通过竞争性地抑制PI3K亚基中的ATP结合位点而抑制其活性,但不抑制PKC、PKA、MAPK等磷酸激酶的表达,因此被认为PI3K/AKT通路研究的可靠工具。已有研究表明LY294002体外可显著抑制大肠癌、卵巢癌、肺癌细胞的生长,但胃癌研究国内尚少见。

　　PI3K由调节亚基p85和催化亚基p110构成,当其被激活时,可催化磷脂酰肌醇的D3羟基磷酸化,生成3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3],然后将AKT磷酸化,激活的AKT可以通过对下游靶蛋白Bad、Caspase9、NFκB、mTOR、Par4、p21等的调节,而介导多种生长因子、胰岛素等诱发到的细胞生长,促进细胞存活[4]。PI3K/Akt信号通路在多种人类肿瘤中表达失调,与肿瘤发生发展密切相关,影响患者的预后。研究表明早期胃癌、中晚期胃癌中PI3K蛋白的阳性表达率均较正常胃黏膜组织高,表达水平与癌细胞分化程度和淋巴结转移均显著相关,提示PI3K/Akt通路与胃癌的转化进展有关。

　　LY294002可导致胃癌细胞存活率下降,显著抑制细胞增殖,并呈浓度时间依赖性,但其具体机制尚不明确。Skp2是近来发现的与肿瘤发生发展高度相关的癌基因,在大多数恶性肿瘤中都存在不同程度的增高,与肿瘤的分化程度、恶性进程和临床预后密切相关[5-7]。Skp2是泛素连接酶E3 SCFSkp2异源四聚体的底物识别亚单位,通过对效应蛋白的泛素化调节,在细胞周期、细胞增殖和分化中发挥了重要作用。其中,Skp2p27途径在细胞增殖中甚为重要。在Skp2/小鼠胰腺beta细胞和生殖细胞中均发现,p27异常聚集导致核内再复制及增大的多倍体细胞,细胞周期停滞,细胞停止增殖[8-9]。Fu等[10]发现,整联蛋白(Integrin)通过阻断PI3K/Akt通路后下调Skp2的转录水平,提高p27的表达从而发挥抗增殖效应。本研究发现,LY294002作用于Skp2高表达的胃癌细胞SGC7901后,细胞中Skp2的mRNA水平随药物浓度增加而显著下降,因此我们推测,阻断PI3K/Akt通路的抗肿瘤细胞增殖效应可能是通过下调Skp2的表达来实现的。

　　NAG1作为一种抑癌基因,已被发现在多种恶性肿瘤中表达异常,如肺癌、前列腺癌、肝癌等,尤其是在胃肠道肿瘤组织中表达明显低于正常组织[11-12]。NAG1低表达的大肠癌对5Fu的化疗敏感性低,表现为细胞凋亡降低[13]。多种化学药物如Cox2抑制剂、小檗碱、槲皮素等通过诱导NAG1表达增高而促使肿瘤细胞凋亡[14-15]。研究发现,Nag1的表达在大肠癌中受到PI3K/AKT通路的调控,而在前列腺癌中则依赖PKC通路的调节[16-17]。本实验经LY294002干预胃癌细胞后,NAG1的转录水平随药物浓度增高而上升。流式细胞术检测LY294002对胃癌细胞凋亡的影响,发现与对照组比较,LY294002可显著诱导细胞凋亡,50 μmol·L-1作用12 h凋亡率即可达(64.1±0.79)%。NAG1促进细胞凋亡的具体机制亦尚不十分明确,有研究发现NAG1能够激活caspases3途径及调节Bcl2的表达[18-19],因此,NAG1的抗肿瘤机制还有待进一步研究。

　　综上所述,LY294002作为PI3K特异性抑制剂可以显著抑制胃癌细胞SGC7901的增殖,诱导癌细胞凋亡,说明PI3K/Akt信号转导通路与胃癌细胞增殖及凋亡密切相关,其机制可能与其对Skp2、NAG1转录的调控有关。本研究结果为PI3K/Akt信号通路成为胃癌治疗的潜在靶点提供了理论依据。

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