鼻腔鼻窦恶性肿瘤细胞周期的DNA分析

　　作者：公蕾，孙洁，薛子超，李敬华，薛卫国 作者单位：青岛大学附属青岛市市立医院耳鼻咽喉-头颈外科, 山东 青岛 266011

　　【关键词】 流式细胞术;DNA指数;S期细胞百分数;鼻窦肿瘤

　　ADNA analysis of the cell cycle in sinonasal neoplasm

　　GONG Lei1, SUN Jie1, XUE Zichao2, LI Jinghua3, XUE Weiguo1

　　(1. Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University,

　　Qingdao 266011, Shandong, China; 2. Department of Clinical Medicine, Grade 2005, Xiangya School of Medicine,

　　Central South University, Changsha 410008, China; 3. Department of Pathology,

　　Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University, Qingdao 266011, Shandong, China)

　　To explore the significance of the cell cycle in sinonasal neoplasm by flow cytometry (FCM). Methods 30 cases of paraffinembedded malignant tumors in nasal cavities or sinuses served as the experimental group and 30 cases of normal mucosa of deflection of the nasal septum as the control group. The DNA index(DI) value and the Sphase fraction(SPF) values were determined by FCM and their correlation was analyzed. Results The DI and SPF values of the experimental group were significantly higher than those of the control group. Conclusion Flow cytometric analysis of DI and SPF plays an important role in diagnosis of sinonasal neoplasm.

　　Key words: Flow cytometry; DNA index; Sphase fraction tumor; Sinus neoplasms

　　鼻腔鼻窦恶性肿瘤是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤之一，近年来流式细胞术(flow cytometry, FCM)已经广泛用于检测癌前病变，诊断良恶性肿瘤，判断恶性肿瘤的分期和分级，指导临床治疗及预后判断[13], 发现DNA指数及S期细胞百分数均与细胞增殖活性及预后有关。我们对青岛市市立医院病理科存档的30例鼻腔鼻窦恶性肿瘤组织及30例鼻中隔正常黏膜进行了研究，报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般材料 鼻腔鼻窦恶性肿瘤组织30例，其中鳞状细胞癌22例，腺样囊性癌3例，淋巴瘤3例，腺癌1例，血管外皮细胞恶性瘤1例。鼻中隔正常黏膜组织30例。

　　1.2 样本制备 切取50?μm厚的组织蜡块4片,用 山东大学耳鼻喉眼学报22卷3期

　　公蕾，等.鼻腔鼻窦恶性肿瘤细胞周期的DNA分析

　　二甲苯脱蜡2?d，经100%、95%、70%、50%梯度酒精及蒸馏水逐级水化,质量分数为0.25%胰酶消化,300目尼龙网过滤，离心,制成单细胞悬液标本,置4?℃?冰箱保存,待检测。

　　1.3 FCM检测 鸡红细胞调节仪器的变异系数在5%以下。碘化丙啶染色后利用流式细胞仪(美国BECKMAN COULTER公司)检测分析DNA含量及细胞周期分布情况。选用MultiCycle AV for Windows advanced DNA Cell Cycle Analysis Software分析细胞核DNA含量和细胞周期分布。

　　1.4 实验判断 以DI表示细胞DNA含量，DI=样品组织G0/G1峰均道值/对照组织G0/G1峰均道值。S期细胞百分数=[S/(G0/G1+S+G2M)]×100%。对照组为鼻中隔偏曲患者的正常黏膜组织,以DI=1.0±0.1作为二倍体DNA的判断标准,此范围之外为异倍体。

　　1.5 统计学处理 用SPSS 11.5统计学软件分别计算两组的DI、SPF值及异倍体率，用t检验对两组进行比较。

　　2 结 果

　　鼻中隔正常黏膜组、恶性肿瘤组的DI值分别为0.99±0.16、1.13±0.16，SPF值分别为9.94±2.57、20.32±3.84。恶性肿瘤组与正常组织比较，P均<0.01，表示两组之间差异有统计学意义，恶性肿瘤组织的DNA含量、SPF值均显著高于正常组织。

　　恶性肿瘤组的异倍体率为30%(9/30)，鼻中隔正常黏膜组为0，两组比较差异有统计学意义，恶性肿瘤组织的异倍体率显著高于正常组织。

　　本实验正常细胞DNA直方图只有单一的G0/G1峰(图1)，没有典型的G0/G1、S、G2期峰,可能与不同组织、细胞增殖能力不同有关;恶性肿瘤DNA直方图表现多样，可出现正常直方图(图1)、异倍体(图2)、G0/G1峰移位(图3)、四倍体(图4)、S期细胞增多(图5)。

　　以鸡红细胞为参照，所测标本G0/G1峰移位，

　　提示细胞分裂异常

　　3 讨 论

　　1983年Hedley发明了石蜡包埋组织制备单细胞悬液的技术，可以从组织切片中获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似，结果可靠。这种方法与活检或手术标本相比，取材更容易，方法更灵敏，结果更快速、准确、客观;且存档的标本成批制作细胞悬液，避免了仪器调试状态不同带来的偏差，而且新鲜细胞与固定细胞的DNA含量差异不大[4]，因此FCM可以对存档的病理资料进行回顾性研究，并得到迅速发展。

　　众所周知，细胞周期是细胞生命活动的基本过程, 细胞核DNA是细胞遗传物质基础，决定着细胞的分化、生长、分裂等各种生物学活动，DNA含量随时相变化而发生周期性变化。人类除肝脏、心肌、男性生殖细胞外，正常体细胞具有较恒定的DNA二倍体含量。当受到致癌因素刺激时,DNA损伤导致 DNA质和量的异常 ,成为DNA非整倍体细胞 ,也称异倍体细胞。肿瘤细胞的 DNA非整倍体是恶性肿瘤的特征性标志之一。检测和分析细胞DNA指数及S期细胞百分数对早期诊断恶性肿瘤具有重要价值。

　　本文的研究结果证实，随着鼻腔组织异型程度加重，DI逐渐增大，提示DNA含量与肿瘤的病变程度有关。SPF值代表细胞群体的增殖活性，它随异型程度加重而增大，提示随着病变的加重，群体中处于增殖期的细胞增多，增殖活性高。

　　Barlogie等[5]总结了文献报道的4?941例各种恶性肿瘤的DNA倍性，约2/3的恶性肿瘤表现为异倍体，其中肺癌的异倍体率最高，为85%，乳腺癌的异倍体率平均为79%。本研究中恶性肿瘤组织的异倍体率是30%，显著高于正常对照组织，提示流式细胞术可以准确区别正常黏膜与肿瘤组织。

　　张炳辉等[6]采用流式细胞术检测喉癌、癌旁、声带息肉中DI及SPF值，DI值分别为1.40±0.72、1.00±0.09、1.03±0.07; SPF值分别为19.61±5.34、2.10±0.96、3.83±1.30，统计显示，喉癌组织中的DI值、SPF值显著高于癌旁及声带息肉,认为DI和SPF值可作为判断喉癌浸润、转移及预后的一个可靠指标。本实验中恶性肿瘤组的DI及SPF值分别为1.13、20.32，而对照组织为0.99、9.94，两组差异有统计学意义，表明恶性肿瘤组织的DNA含量高，增殖活性强，与上述研究结论一致。提示DI及SPF可以作为判定鼻肿瘤性质的参考指标，流式细胞术检测鼻腔鼻窦恶性肿瘤细胞周期的DNA分析可作为鼻肿瘤的检测手段之一。

　　【参考文献】

　　[1] Zuo L F, Lin P Z, Qi F Y, et al. Flow cytometric analysis of DNA, telomerase content and mutigene expression in esophageal epithelial dysplasia[J]. World J Gastroenterol, 2003, 9(11):24092412.

　　[2] 范玲玲，韩辉.宫颈液基细胞学和DNA倍体检查用于宫颈癌筛查309例报告[J]. 福建医科大学学报，2006，40(2)：187188.

　　[3] Ma J, Nicholas, Terry H A, et al. Prognostic significance of DNA ploidy and proliferative indices in patients with nasopharyngeal carcinoma[J]. Ai Zheng, 2002, 21(6):644650.

　　[4] 陶德定，冷彦，覃吉超，等.新鲜肿瘤标本活细胞与固定细胞的DNA含量分析比较[J]. 癌症, 2001, 20(5):502504.

　　[5] Barlogie B, Raber M N, Schmmann J, et al. Flow cytometry in clinic cancer research[J]. Cancer Res, 1983， 43:3982.

　　[6]张炳辉,徐秀玉,韩瑞珠,等. DNA含量和SPF值与喉癌浸润转移的相关性研究[J]. 哈尔滨医科大学学报,2003，37(2)：140143.