靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应

　　作者：朱春生，陈剑秋 作者单位：济南军区总医院耳鼻咽喉头颈外科， 济南 250031

　　【摘要】目的 研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。 方法 刺激人外周血淋巴细胞增殖，提取总DNA。采用RTPCR扩增含有IL2信号肽和TRAIL功能区的融合基因，克隆入pGL3181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游，构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人黑色素瘤细胞株A375中，以台盼蓝拒染法和电镜下细胞形态变化，观察转染的A375细胞的凋亡。结果 构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3181hTERT/TRAIL，其表达产物能诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡。结论 成功地构建了重组真核表达载体pGL3181hTERT /TRAIL，为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。

　　【关键词】 TRAIL 端粒酶启动子 凋亡 基因治疗

　　ZHU Chunsheng, CHEN Jianqiu

　　(Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery, Jinan Military General Hospital, Jinan 250031, China)

　　To explore the targeted gene therapy of tumors by using the TRAIL gene in combination with the telomerase promoter. Methods Total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes (PBL) whose proliferation had been stimulated. The TRAIL gene with an IL2 signal peptide gene was amplified by RTPCR and cloned into the vector pGL3181hTERT downstream of the hTERT promoter to form a eukaryotic expressing vector. A375 cells were transfected by the recombinant vector and apoptosis of the transfected cells was evaluated by rypanblue exclusion and transmission electron microscopy (TEM). Results We successfully constructed a recombinant eukaryotic expression vector for the TRAIL gene. The expressed product significantly induced the apoptosis of the A375 cells. Conclusion The recombinant eukaryotic expression vector pGL3IL181hTERT/TRAIL was successfully constructed, which provides the possibility for gene therapy of tumors.

　　Key words： TRAIL; Telomerase promoter; Apoptosis; Gene therapy

　　细胞凋亡是多种信号蛋白通过数种途径传导的复杂过程，目前明确两种途径调节凋亡，一是死亡受体途径(外部途径)，二是线粒体途径(内部途径)，两种途径相互交叉存在。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNFrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族的成员，其分子结构与CD95L及TNF类似，具有典型的Ⅱ型跨膜蛋白的特征[1]，是死亡受体配体，通过外部途径对多种肿瘤细胞具有诱导凋亡作用 。由于TRAIL可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞基本无影响[23]，故自发现以来一直被视为极具潜力的特异性抗肿瘤分子。目前已证实，TRAIL可杀伤白血病细胞、乳腺癌细胞结直肠肿瘤细胞、黑色素瘤细胞、恶性胶质瘤细胞、前列腺癌细胞及HIV患者的淋巴细胞，被认为是一种很有前途的广谱抗癌分子。但也有研究表明，人肝细胞、胸腺、神经细胞及星形细胞，也对TRAIL诱导的凋亡敏感[46]，因而需要寻求能够增加TRAIL对肿瘤细胞的特异诱导凋亡作用而避免损伤人正常组织细胞的方法。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因的启动子属于肿瘤特异性启动子，对肿瘤细胞具有特异性，可在转录水平调控目的基因的表达以确保对肿瘤细胞的杀伤，而正常组织细胞则不受到伤害，降低了基因治疗的毒副作用。为此，我们利用端粒酶基因的启动子转录TRAIL基因，并使其在肿瘤细胞内呈特异性表达，以期解决肿瘤基因治疗中的靶向性问题。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 各种酶及DMEM培养基，均购自TaKaLa公司。Trizol总试剂盒、RTPCR试剂盒、Western blot化学发光试剂盒及胰蛋白酶购自GibcoBRL公司。脂质体Lipofect AMINETM2000购自Invitrogen公司。DNA提取试剂盒购自上海基康公司。测序载体pGEM T Easy购自Promega公司。含有hTERT核心启动子的pGL3181hTERT质粒，由日本Kanzawa大学Satoru Kyo教授惠赠。人黑色素瘤细胞株A375购自军事医学科学院。正常人肝细胞株HL7702购自武汉大学细胞保藏中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 总RNA的提取 清晨空腹静脉抽血10mL，利用淋巴细胞分离液分离纯化PBL(外周血淋巴细胞)，用无血清的DMEM洗2次，每次1000r/min离心10min，用含50mL/L小牛血清的DMEM调整细胞浓度至5.0×105/mL，加入PHA至终浓度为20mg/L，置37℃、5%CO2中培养48h;离心，去上清，加入等体积的PBS重悬细胞;用淋巴细胞分离液去除死细胞及细胞碎片，获得纯化的PBL;用含50mL/L小牛血清、IL2(终浓度为20U/mL)的DMEM培养3d。增殖后的细胞总数1×106，用PBS洗2次，采用Trizol试剂提取总RNA。紫外分光光度计检查所提总RNA浓度和纯度，OD260/OD280≈1.9，并用1.1%变性甲醛琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

　　1.2.2 RTPCR扩增TRAIL cDNA 根据TRAIL cDNA的序列和IL2信号肽基因的序列以及质粒pGL3181hTERT的序列，设计扩增IL2信号肽基因与TRAIL cDNA片段融合基因的3条引物。下游引物的5′端加入Xba I酶切位点，上游引物2的5′端加入HindⅢ酶切位点。上游引物1的序列为：5′GCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGTGAGAGAAAGAGGTC3′，上游引物2为：5′GCAAGCTTGGCATTC CGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTG3′;下游引物为：5′GGCTCTAGATTAGCCAACTAA

　　AAAGG3′。取3μg总RNA，以oligo(dT)20为引物，按RTPCR试剂盒说明进行。以上游引物1和下游引物进行PCR，条件为：于94℃、52℃、72℃各1min，共循环35次，再于72℃　10min、4℃保存。以上游引物2和下游引物进行PCR，条件为：于94℃、60℃、72℃各1min，共循环35次，再于72℃　10min、4℃保存。PCR反应体系为100μL，其中10μmol/L上下游引物各5μL、模板4μL。PCR产物以1.5g/L琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。

　　1.2.3 测序载体pGEM T Easy/TRAIL的构建及序列鉴定 扩增产物进行凝胶电泳后，按凝胶回收试剂盒中的操作说明，回收扩增的大小为613bp的TRAIL基因。将回收产物进行末端添A(dATP)反应(操作步骤按说明书)，然后以常规方法连接入pGEM T Easy载体中并测序。以连接产物pGEM T Easy/TRAIL经CaCl2转化法转化JM109菌株，用氨苄青霉素和蓝白斑进行双筛选。挑取白色菌落，按DNA提取试剂盒的说明提取质粒，以HindⅢ和Xba I双酶切鉴定，并送上海基康公司以T7通用引物进行测序。

　　1.2.4 TRAIL基因真核表达载体的构建 选取测序正确的载体pGEM T Easy/TRAIL，经Hind Ⅲ和Xba I双酶切、低熔点凝胶电泳后，回收613bp的TRAIL cDNA与IL2信号肽基因融合的扩增片段，同时对空载体pGL3181hTERT也经上述处理后，回收3.33kb的载体大片段。按目的基因和载体片段的摩尔数比为3∶1连接后，即构建成pGL3181hTERT/TRAIL。以连接产物转化大肠杆菌，依次经扩大培养、提取质粒，及Hind　Ⅲ和Xba I双酶切后，用pGL3181hTERT载体的RV primer3引物和下游引物进行PCR，鉴定重组真核表达载体及插入方向，命名为pGL3181 hTERT/TRAIL。

　　1.2.5 Western Blot免疫印迹反应 将上述转染细胞培养48h，收集上清及细胞，经浓缩、蛋白质初步纯化，全部样品加样于12%浓缩胶、4%分离胶。上样后电压为120V约40min，样品进入分离胶后电压升至160V约2.5h，用0.5%考马斯亮蓝R250振荡染色2～3h，脱色直至背景清晰，行SDSPAGE。按照Western blot化学发光试剂盒说明行抗体结合、显色、胶片冲洗后，经凝胶成像系统打印。

　　1.2.6 瞬时转染及细胞凋亡的检测 将人黑色素瘤细胞株A375和正常人肝细胞株HL7702在DM EM10培养液中培养至对数生长期，加入到12孔培养板中，7×104个细胞/孔。待细胞生长至70%的汇合时，按试剂盒中的操作说明，在阳离子脂质体Lipofect AMINE的介导下，分别以pGL3181hTER T/TRAIL及空载体pGL3181hTERT转染转染上述两种细胞。培养5h后，换含小牛血清的DMEM20培基液培养，24h后再换含小牛血清的DMEM10培基液继续培养。分别在培养的0、24、48、72及96h，取出细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化后，以台盼蓝拒染法计数A375细胞和HL7702细胞中的活细胞数[7]。另外在一6孔培养板转染A375和HL7702细胞，方法同上。48h后消化、收集细胞，用3%戊二醛4℃固定1h，常规包埋、超薄切片，透视电镜下观察。

　　2 结 果

　　2.1 TRAIL cDNA的扩增 通过RTPCR，扩增得到带有IL2信号肽基因的TRAIL cDNA功能区的融合片段。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示，扩增的TRAIL基因片段的大小为613bp，无杂带、特异性好，符合预期的结果(图 1)。

　　2.2 pGL3181hTERT/TRAIL的成功构建 DNA序列测定表明所克隆的TRAIL cDNA序列与GenBank中登录的相应序列完全相同。测序载体pGEM T Easy/TRAIL经Hind Ⅲ和Xba I双酶切后，可切下带有IL2信号肽基因的TRAIL片段。将其亚克隆入真核表达载体pGL3181hTE RT端粒酶启动子的下游，取阳性克隆以上述两种酶进行双酶切及PCR鉴定。结果表明，扩增的TRAIL基因已正确插入质粒pGL3181hTERT中，构建成重组真核表达载体pGL3181 hTERT/TRAIL(图 2)。

　　2.3 转染后TRAIL基因的诱导表达 瞬时转染后的上清，行Western Blot免疫印迹,在相对分子量18kD处附近有一条带，与预期相对分子质量一致，显示所表达的蛋白为人可溶性TRAIL蛋白。作为内参照组的细胞均有βactin蛋白的表达。(见图3)

　　2.4 重组真核表达载体转染的A375细胞的凋亡 将重组真核表达载体pGL3181hTERT/TRAIL经阳离子脂质体lipofect AMINE介导转染人黑色素瘤细胞A375和正常人肝细胞HL7702，以空载体pGL3181hTERT转染的细胞为对照，用台盼蓝拒染法，检测转染后0、24、48、72和96h A375及HL7702细胞的存活数。结果表明，重组真核表达载体pGL3181hTERT/TRAIL表达的TRAIL可诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡，于转染后第2天凋亡细胞数逐渐增多;而正常肝细胞HL7702则生长良好(P<0.05)，(图4)。

　　3 讨 论

　　黑色素瘤约占全身恶性肿瘤的1%，鼻腔黑色素瘤由于局部解剖复杂和隐蔽而成为一种症状不典型的恶性度高和复发率高的恶性肿瘤，容易发生血行和/或淋巴结转移，预后差，目前根治性切除仍然是治疗主要手段。近年来随着免疫学及分子生物学进展，生物治疗晚期黑色素瘤取得了一定临床疗效，但肿瘤的发生直接与基因的改变有关，因此，从基因水平研究肿瘤的治疗给人们带来了新的希望。凋亡功能的失调在影响黑色素瘤的生物学行为上起重要作用，其中包括促凋亡基因TRAIL、P53等。与非变异细胞相比较，一些表达高水平的TRAIL受体的肿瘤细胞对暴露于TRAIL处理诱发TRAIL介导的凋亡更具敏感性，而黑色素瘤细胞TRAIL的表达活性下降，导致TRAIL介导的凋亡减弱[7]。TRAIL诱导凋亡的调控主要是在受体的表达水平而实现的。DR4和DR5是死亡受体，在许多肿瘤细胞和正常细胞表面都有不同程度的表达。为了高效、持续地杀伤肿瘤细胞而又不损伤正常细胞，基因治疗的特异性、高效性和时序性仍需进一步完善。

　　端粒酶是一种特殊的逆转录酶，是目前已知最为广谱的肿瘤分子标记物。端粒酶在绝大多数肿瘤组织和几乎所有的永生化细胞中均有明显的表达活性，而在正常人体细胞、部分良性肿瘤和非永生化细胞中几乎无活性表达[8]。hTERT基因在转录水平上的表达量与端粒酶的活性成正比。因此，近年来已成为肿瘤的基因治疗中在转录水平上控制肿瘤的研究热点。现已有使用hTERT启动子成功地对骨肉瘤、胶质瘤、膀胱癌及肝细胞肝癌等恶性肿瘤进行靶向基因治疗的报道。 研究发现，67%～96%的原发性头颈部肿瘤有端粒酶活性表达，恶性黑色素瘤的hTR阳性表达率明显高于黑色素细胞痣和正常皮肤，且转移性恶性黑色素瘤的hRT阳性表达显著强于原发性恶性黑色素瘤，提示黑色素瘤中hTERT具有高的表达活性[9]。虽然对黑色素瘤侵袭、转移特性的始发因素及获得抗凋亡能力的机制理解不多，但理解参与凋亡途径的这些分子的作用，或许能为黑色素瘤的治疗提供一个新方法。

　　本实验利用端粒酶及其基因启动子的活性在肿瘤细胞和正常细胞中表达的差异，以hTERT启动子作为调控序列来控制凋亡基因的表达，将其严格地控制在肿瘤细胞中，实现转录水平的特异性调控。我们成功地构建了重组pGL3181hTERT/TRAIL载体，以其转染A375细胞后，表达的TRAIL可诱导A375细胞凋亡，而对正常肝细胞则无影响，为人鼻腔恶性黑色素瘤的靶向性基因治疗提供了可能性。

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