乳腺癌组织中MMP

　　作者：李洪涛 宁连胜 张斌 　　(河北北方学院附属第一医院肿瘤外科,河北 张家口 075000;天津医科大学附属肿瘤医院乳腺一科，天津 300070)

　　【摘要】 目的：探讨基质金属蛋白酶MMP2、MMP9在乳腺癌中的表达情况及与临床预后的关系。方法：采用组织芯片及免疫组化SP法检测了183例乳腺癌组织中MMP2、MMP9的表达水平。结果：①乳腺癌组织中MMP2和MMP9的阳性表达率分别为770%(141/183)和656%(120/183)。乳腺癌组与良性对照组MMP2、MMP9的表达具有显著性差异( P<001)。 ②MMP2的表达与肿瘤大小有关(P=0010)，与临床TNM分期、淋巴结转移状态、组织学分级密切相关(P均<001);MMP9的表达与组织学分级有关(P=0012)，与肿瘤大小、临床TNM分期、淋巴结转移状态密切相关(P均<001); MMP2和MMP9的表达与年龄、月经状态、病理类型以及雌孕激素受体状态无关。③MMP2、MMP9高表达组10年生存率均低于低表达组。结论：MMP2、MMP9均可作为乳腺癌患者预后判断的指标。

　　【关键词】 乳腺癌;基质金属蛋白酶;组织芯片;诊断;预后

　　Expressions and Prognosis Importance of MMP2 and MMP9 in Breast Cancer

　　LI Hongtao, NING Liansheng, ZHANG Bin

　　Department of Oncology,The First Affiliated Hospital，Heibei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China;Department of Breast, The Cancertreating Hospital，Tianjin Medical University, Tianjin, 300070,China

　　【ABSTRACT】 Objective: To observe the expressions of MMP2 and MMP9 in breast cancer, and investigate their correlation with the clinical prognosis for breast cancer Methods: MMP2 and MMP9 were detected by Microarray and SP immunohistochemical technique in 183 patients with breast cancerResults: ①The expression levels of MMP2 (770%) and MMP9 (656%) in the breast cancer tissues were significantly higher than those of benign breast diseases (P <001)②MMP2 was correlated with the tumor size (P =0010), and significantly correlated with clinical TNM stage, histological grade, and lymph node status MMP9 was correlated with the histological grade (P =0012), and significantly correlated with tumor size, clinical TNM stage, and lymph node status (P <001) MMP2 and MMP9 had no correlation with age, pathological type, the status of ER and PR③The survival rate of 10 years in the group of MMP2 and MMP9 overexpression was lower than that of lowexpression the group.Conclusion: MMP2 and MMP9 all could serve as markers for prognosis judgment of breast cancer patients.

　　【KEY WORDS】 Breast cancer; Matrix Metalloproteinases; Microarray; Diagnosis;Prognosis

　　浸润和转移恶性肿瘤的主要生物学特征，也是恶性肿瘤患者的主要死亡原因。人们通过对肿瘤浸润和转移机制广泛研究后发现细胞外基质在肿瘤的浸润和转移过程中起关键性作用。而MMPs/TIMPs的相对平衡决定着细胞外基质的降解和聚集。我们采用组织芯片免疫组化SP法检测了183例乳腺癌组织中MMP2、MMP9的表达水平，并结合10年随访资料探讨MMP2、MMP9对乳腺癌患者预后的影响。

　　1 材料与方法

　　11 材料 收集天津医科大学附属肿瘤医院乳腺病理科1993年手术切除乳腺癌石蜡包埋标本183例。年龄24~75岁，平均4926岁。按2003年世界卫生组织(WHO)乳腺肿瘤组织学类型修订方案，对全部资料进行统一命名和分类：浸润性导管癌124例，浸润性小叶癌28例，其他类型癌31例。临床分期Ⅰ期22例，Ⅱ期93例，Ⅲ~Ⅳ期68例。组织学分级Ⅰ级67例，Ⅱ级57例，Ⅲ级59例。有淋巴结转移者97例，无淋巴结转移者86例。对照组取自同期乳腺良性病变30例。

　　12 方法

　　121 制作组织芯片：①HE切片于显微镜下明确并标记癌巢。②借助HE切片于供体蜡块的相应部位进行标记作为取材部位。③组织芯片模块制作：将普通病理石蜡熔化，反复沉淀3次，加入3%精制蜂蜡，制作40cm×20cm×10cm大小的空白蜡块，室温冷却。④组织芯片的设计和制备：设计10×8点组织列阵，用打孔机制成模块，用直径06mm的打孔针从供体蜡块的选定部位逐个取出组织芯，随即放入预先设计的阵列模块中，排列成组织芯片模块，将制成的组织芯片模块置于60℃温箱中50min，轻压模块使组织芯在模块中排平。将制成的模块常规切成4μm的切片裱于硅化玻片上，60℃温箱过夜。

　　122 采用免疫组织化学SP法检测：鼠抗人MMP2单克隆抗体购自北京中杉生物技术有限公司。MMP9及SP试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司，按说明书要求做抗原热修复处理。用己知阳性的胎盘或乳腺癌组织切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

　　13 阳性结果判断标准：结果判断按Shimizu方法[1]，对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别打0、1、2、3分，着色阳性面积按无着色、着色< 1/3、1/3～2/3、>2/3分别打0、1、2、3分，然后根据两项打分之和判断其结果：0分为阴性，≥3分为阳性，其中5分者为强阳性(注：每张切片选择有代表性的区域，在400倍视野下进行计数，共计5个视野，取其平均值以避免随意性)。

　　14 统计学方法 MMP2、MMP9与临床病理指标关系的比较，采用行×列表进行χ2检验，生存曲线的比较采用KaplanMeier法。α值等于005为显著检验水准。均在计算机上由SPSS 130统计软件进行。

　　2 结果

　　21 乳腺癌组织和对照组MMP2、MMP9的表达

　　在乳腺癌组织中MMP2和MMP9的阳性表达率分别为770%(141/183)和656%(120/183)。阳性表达主要定位于肿瘤细胞膜和细胞浆。且阳性物质主要分布于肿瘤细胞，少数分布于肿瘤间质，而间质中主要是巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和胶原纤维着色。对照组MMP2有5例，MMP9有2例呈弱阳性表达，其余均为阴性。乳腺癌组与良性对照组MMP2、MMP9的表达具有显著性差异(P <001)。

　　22 乳腺癌组织中MMP2、MMP9表达与临床病理因素之间的关系乳腺癌中MMP2的表达与肿瘤大小有关(P=0010)，与临床TNM分期、淋巴结转移状态、组织学分级密切相关(P均<001)，而MMP2表达与年龄、月经状态、病理类型以及雌孕激素受体状态无关; MMP9的表达与组织学分级有关(P=0012)，与肿瘤大小、临床TNM分期、淋巴结转移状态密切相关(P均<001);而与年龄、月经状态、病理类型以及雌孕激素受体状态无关。详见表1。

　　23 MMP2、MMP9不同表达水平对乳腺癌患者术后生存的影响MMP2低表达组(-～+)10年生存率为100%，而高表达组(++～+++)10年生存率为667%，两组比较有明显统计学差异(P<001)，详见图1。MMP9低表达组(-～+)10年生存率为100%，而高表达组(++～+++)10年生存率为655%，两组比较有明显统计学差异(P<001)，详见图2。

　　3 讨论

　　肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程：首先，肿瘤细胞与基底膜表面的整合素受体及非整合素受体结合;第二，破坏由细胞间质和基底膜组成的ECM;最后，穿过ECM缺损进入局部淋巴管系统及毛细血管，在远隔部位突破毛细血管结构，形成新的转移灶。ECM主要有间质胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维粘连蛋白、硫酸肝素蛋白多糖等组成，处在不断代谢更新、降解重塑的动态平衡中，可维持肿瘤细胞生长的微环境，并可调节与其接触的肿瘤细胞的基因表达，从而影响肿瘤的代谢、生长及转移。故任何破坏ECM动态平衡的物质都可能与肿瘤的浸润转移密切相关。其中，MMPs作为基质中最重要的蛋白水解系统，是近年来研究热点之一。MMPs是自然进化中高度保守的一类酶，广泛分布于植物、脊椎动物和无脊椎动物中，是细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分。目前至少发现了28个家族成员。根据作用底物及结构的不同，MMPs通常分为4类：胶原酶，明胶酶，基质溶解素，膜型MMPs。目前乳腺癌相关研究多集中于MMP1、2、3、9、11、13、19，如：MMP1与硬癌关系密切[2]，MMP2和MMP9与淋巴结转移以及血管形成有关，MMP11被认为是高度浸润性肿瘤和原发乳癌分期较晚的标志，MMP2被认为是乳癌低生存率的独立预后因素[3]等。

　　表1 MMP2和MMP9表达与临床病理因素之间的关系(略)

　　图1 MMP2高表达组和低表达组(略)

　　图2 MMP9高表达组和低表达组(略)

　　乳腺癌患者术后10年生存曲线乳腺癌患者术后10年生存曲线

　　MMP2是金属蛋白酶家族中与肿瘤关系最为密切的因子之一。MMP2是一种锌离子依赖的蛋白水解酶，由肿瘤细胞和间质细胞以酶原形式分泌，经水解后激活，能特异性地降解基底膜的主要成分―Ⅳ型胶原，还可降解Ⅴ、Ⅵ 、Ⅹ型胶原、FN和明胶;MMP9是基质金属蛋白酶家族中分子量最大的酶，它以酶原的形式分泌，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，降解、破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质中的Ⅳ型、V型胶原和明胶。上世纪90年代末到本世纪初，国内外学者对于MMPs在乳腺癌中的表达进行了大量的研究。Jones 等[4]通过免疫组化方法发现MMP2主要在乳腺癌细胞胞浆内或胞膜表达，在正常乳腺的导管和腺泡周围的基底膜也可表达。Lebeau A等[5]应用免疫组化和原位杂交的方法检测了70例浸润性乳腺癌标本中的MMP2、MMP9的表达，结果显示：MMPs蛋白和mRNA表达于肿瘤细胞及周围的基质细胞，在肿瘤浸润的边缘MMPs表达增强。范松青等[6]采用原位杂交、免疫组化检测66例有临床和随访资料的乳腺癌患者的MMP2mRNA和MMP2、MMP9蛋白表达。结果：MMP2和MMP9蛋白的阳性表达率分别为712%和682%。袁莲香等[7]采用免疫组化LSAB法对50例具有完整临床资料的乳腺癌组织及20例乳腺纤维腺瘤的组织标本分别进行MMP2和MMP9检测。结果：50例乳腺癌组织中MMP2和MMP9的阳性表达率分别为74%和65%。本研究结果显示：乳腺癌组织中MMP2和MMP9均呈棕黄色颗粒，定位于肿瘤细胞膜和细胞浆。且阳性物质主要分布于肿瘤细胞，少数分布于肿瘤间质，而间质中主要是巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和胶原纤维着色。阳性物质的分布呈灶性，在肿瘤边缘浸润区着色最强。乳腺癌组织中MMP2(770%), MMP9(656%)的阳性表达率均显著高于良性乳腺疾病，具有统计学意义(P均<001)，与文献报道相符。提示乳腺癌组织可能具有较强的分泌MMPs的能力。由于肿瘤细胞的异质性，MMPs在肿瘤组织中的表达也呈现不均一性，本研究中MMP2和MMP9多表达于肿瘤细胞浸润的前沿，这与瘤细胞侵袭的生物学特性符合。近年来，MMPs与临床病理因素的相互关系是国内外学者研究的焦点问题。大量研究表明，MMPs与乳腺癌的浸润、转移关系密切。Rahko E等[8]应用免疫组化的方法检测了168例绝经后局部晚期乳腺癌标本的MMP9表达水平，结果显示： MMP9表达与临床分期、病理类型以及激素受体状态无关。Li HC等[9]检测了270例腋淋巴结阴性乳腺癌标本中的MMP2和MMP9表达水平，结果显示：MMP2表达与肿瘤大小和组织学分级正相关，MMP9表达与组织学分级正相关。何旭等[10]应用免疫组织化学SP法，检测49例乳腺癌、10例癌旁正常组织中MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2的表达及分布，结果：乳腺癌组织中MMP2 、MMP9的表达与组织学分级、淋巴结转移密切相关(P<005)，能促进乳腺癌的侵袭和转移，而TIMP1、TIMP2的表达与肿瘤生物学行为无相关性(P >005)。葛凤霞等[11]检测58例乳腺癌蜡块中MMP2与MMP9的表达水平，结果：MMP2和MMP9的表达与乳腺癌患者的年龄及肿瘤大小无关;MMP2与淋巴结转移有关，有淋巴结转移者，MMP2表达较高，无淋巴结转移者，MMP2表达较低;而MMP9的表达与淋巴结转移情况则无关;MMP2和MMP9的表达与病理分级有关，病理分级越高，MMP2及MMP9表达越高。本研究的结果表明：乳腺癌中MMP2的表达与肿瘤大小有关(P=0010)，与临床TNM分期、淋巴结转移状态、组织学分级密切相关(P均<001);MMP9的表达与组织学分级有关(P=0012)，与肿瘤大小、临床TNM分期、淋巴结转移状态密切相关(P均<001);而MMP2和MMP9的表达与年龄、月经状态、病理类型以及雌孕激素受体状态无关。我们的研究采用了高通量组织芯片的方法，在相同的实验条件下，对183例乳腺癌较大标本，一次性进行MMP2和MMP9检测，结果有一定的参考价值。MMPs对乳腺癌患者预后的影响是近年来国内外学者研究的另一焦点。比较早开始这方面研究的是Diadone等[12]，他在1991年就选择187个腋窝淋巴结阴性并接受根治术的病人进行回顾性研究。用免疫组化的方法研究IV型胶原酶与乳腺癌预后的关系。结果发现IV型胶原酶的表达与病人的无复发生存期及总生存期无关。但IV型胶原酶的表达却与局部淋巴结复发率高相关。然而，TalvensaariMattila等[13]的研究却有相反的结论，他回顾了1981~1987年的177个经手术治疗的乳腺癌病人，中值随访期92个月，用免疫组化的方法研究MMP2与乳腺癌预后的关系。研究者发现，MMP2染色阳性与病人的总生存期有关。经5年随访统计，肿瘤MMP2染色阴性的病人有88%存活，而强阳性的病人只有56%存活，弱阳性及中度阳性的有73%存活，差别均有统计学意义，MMP2可以作为乳腺癌的独立预后因子。Leppa S等[14]通过酶联免疫测定133例腋淋巴结阳性乳腺癌患者血浆中MMP2和MMP9水平，并随访5年，结果显示：MMP2低表达组5年无病生存率和总生存率均明显高于高表达组，且MMP2低表达组骨转移和内脏转移率较低。MMP2与淋巴结状态、孕激素受体状态、肿瘤大小是独立的预后因素。而血浆MMP9水平与预后无关。Rahko E等[15]应用免疫组化的方法检测了168例绝经后局部晚期乳腺癌标本的MMP9表达水平，结果显示：雌激素受体阴性而MMP9阳性的患者5年生存率为37%，雌激素受体和MMP9均为阴性的患者5年生存率为63%，提示MMP9有一定的预后价值。本研究对我院存档的1993年183例有完整10年随访资料的乳腺癌病理蜡块进行MMP2和MMP9检测，得到以下结论： MMP2低表达组(-~+)10年生存率为100%，而高表达组(++~+++)10年生存率为667%，两组比较有明显差异(P<001);MMP9低表达组(-~+)10年生存率为100%，而高表达组(++~+++)10年生存率为655%，两组比较有明显差异(P<001)。提示MMP2、和MMP9均可作为乳腺癌患者预后判断的指标。本研究结果的优势在于，利用组织芯片的方法对大样本进行多指标检测，并结合完整10年随访资料进行预后分析，国内外尚未见相似报道，具有较高的可信性。

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