喉鳞癌组织中Claudin3和Ecad表达的临床意义

　　作者：韩凤艳 刘爱东1 作者单位：1 唐山职业技术学院病理教研室(唐山市协和医院病理科,河北 唐山 063000)

　　【摘要】 目的 检测Claudin3及上皮型黏附素(Ecad)在喉鳞癌中的表达，探讨二者在喉鳞癌发生发展及转移中的作用。方法 应用免疫组织化学法检测98例喉鳞癌组织及30例正常喉黏膜组织中Claudin3、Ecad蛋白的表达情况，并将检测结果与临床病理特征进行综合分析。结果 Claudin3蛋白阳性表达主要定位于喉鳞癌癌旁正常黏膜细胞质和细胞膜，Ecad蛋白阳性表达主要定位于喉鳞癌癌旁正常黏膜细胞膜，Claudin3、Ecad蛋白在喉鳞癌中表达的阳性率明显低于正常黏膜。喉鳞癌中Claudin3和Ecad蛋白的表达与肿物大小、分化程度、有无甲状软骨累及和淋巴结转移密切相关。结论 Claudin3和Ecad在喉鳞癌组织中表达下调，二者可能与喉鳞癌的发生发展有关，联合检测Claudin3和Ecad可能与喉鳞癌的预后密切相关。

　　【关键词】 喉鳞癌;Claudin3;Ecadherin;免疫组织化学

　　喉鳞癌的发生发展是涉及多个蛋白水平的变化，而细胞间的黏附力丢失常导致细胞连接的破坏〔1〕。Claudin3是紧密连接的主要跨膜蛋白，此蛋白在细胞间传输转运中起重要接头作用，是细胞黏附功能的基础，研究表明Claudin3在众多肿瘤组织中异常表达〔2〕。Ecad是钙依赖的黏附素家族的一个经典成员。本文应用免疫组织化学方法检测喉鳞癌组织中Claudin3和Ecad蛋白的表达情况，并分析其与临床病理特征的相互关系，以深入探讨二者在喉鳞癌发生发展中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　收集2005年8月至2008年8月本院病理科喉鳞癌切除标本作为实验组，共98例，年龄为31～79(平均51.3)岁。其中男76例，女22例，有淋巴结转移的35例，无淋巴结转移的63例，术前均未进行放化疗，同时选取30例癌旁正常黏膜组织为对照组。

　　1.2 试剂

　　实验用的兔抗人Claudin3多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供，鼠抗人Ecad单克隆抗体，SP和DAB显色试剂盒均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

　　1.3 免疫组织化学方法检测二种蛋白的表达

　　Claudin3和Ecad蛋白的表达应用免疫组织化学SP法进行。主要步骤：①将5 μm切片脱蜡水化后，用PBS冲洗3次，每次3 min。②用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复。③每张切片加1滴过氧化物阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。④PBS冲洗3次，每次3 min。⑤甩去PBS液，每张切片加1滴非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10 min。⑥甩去血清，每张切片加1滴第一抗体，室温下孵育60 min或4℃过夜。⑦PBS冲洗3次，每次3 min。⑧甩去PBS液，每张切片加1滴生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10 min。⑨PBS冲洗3次，每次3 min。⑩甩去PBS液，每张切片加1滴链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次3 min。甩去PBS液，每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10 min，阳性显色为棕色。自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，PBS冲洗返蓝。切片经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

　　1.4 结果判定标准

　　Claudin3蛋白阳性染色位于细胞膜和细胞质，光镜下以细胞膜与细胞质同时出现棕黄色着色为阳性细胞，细胞无着色或者单纯细胞质着色、细胞膜着色为阴性细胞。Ecad蛋白阳性染色位于细胞膜，呈棕黄色为阳性细胞，细胞无着色或者淡黄色为阴性细胞。合并计算高倍镜下(×400)随机选择的5个视野中阳性细胞占全部计数肿瘤细胞的百分率，平均每个视野细胞质(膜)呈阳性反应的细胞数≥10%为阳性，无明显阳性反应或阳性反应的细胞数<10%为阴性。

　　1.5 统计学分析

　　采用SAS6.12软件进行χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 Claudin3和Ecad在喉癌与正常黏膜中的表达

　　Claudin3和Ecad在喉鳞癌中表达的阳性率明显低于正常黏膜(P<0.000 1)。见表1，图1。表1 Claudin3和Ecad在喉癌与正常黏膜中的阳性表达

　　2.2 Claudin3和Ecad的表达与喉鳞癌临床病理特征的关系

　　喉鳞癌Claudin3和Ecad蛋白的表达与肿物大小、分化程度、有无甲状软骨累及和淋巴结转移情况密切相关，而与患者的年龄及性别无明显相关。见表2。图1 Ecad和Claudin3在喉癌组织和正常黏膜组织中的表达(×400)表2 Claudin3和Ecad的阳性表达与喉鳞癌临床病理特征的关系

　　3 讨 论

　　Claudins是一类跨膜蛋白，是从鸡肝中得到的一种紧密连接的片段，迄今在人体内发现至少有24种不同蛋白，分子量大约为20～27 kD之间。近年有研究显示，多种上皮性恶性肿瘤Claudins有异常表达，并且与这些肿瘤发生和发展有密切关系〔1〕。Claudin3是其家族的重要成员，不仅具有调节细胞间物质流动和维持上皮细胞极性的功能，而且还参与细胞增殖分化、基因转录、肿瘤抑制等过程。但我们发现Claudin3在不同肿瘤中的表达并不完全相同。Soini等〔3〕通过免疫组化研究表明Claudin3在肾癌、膀胱癌中的表达下调。Long等〔4〕利用Northen印迹发现在人类前列腺上皮中，Claudin3基因转录的mRNA量较周围正常组织明显增高，同时用免疫组化发现Claudin3蛋白在骨转移灶中的表达也是增高的。Resnick〔5〕等发现Claudin3在肠型胃癌中是高表达的。但是Claudin3在喉鳞癌中的表达未见报道。黏附素是一组Ca2+依赖跨膜蛋白，包括至少9个基因家族，其中以Ecad最为重要，是钙依赖的黏附素家族的一个经典成员。近年来，有关紧密连接蛋白及黏附分子功能的研究日趋增多，并证实了其在肿瘤发生发展中的重要作用〔6〕。当肿瘤组织中Ecad发生结构功能异常，如转录受抑、基因突变、启动子区域甲基化、β连接蛋白磷酸化时，其细胞黏附功能发生障碍，不仅可使细胞分化降低，而且可致肿瘤细胞侵袭性生长，并易脱离原发部位，向深部浸润而发生局部或远处转移。本实验通过免疫组织化学方法检测Claudin3和Ecad在喉鳞癌中的表达，发现Claudin3、Ecad的阳性表达率比对照组明显降低，且都与喉癌的分化程度、肿物大小、是否累及甲状软骨及有无淋巴结转移密切相关。这些结果既提示Claudin3和Ecad在喉癌发生发展中可能起相当重要的作用，又由于分化程度、肿物大小、是否累及甲状软骨及有无淋巴结转移是与喉鳞癌患者预后密切相关的因素，因此提示二者低表达可能与患者的预后不良密切相关。Claudin3促进肿瘤生长可能有：①引起紧密连接屏障的破坏，导致营养素、生长因子和其他活性分子向肿瘤内部转运，促使肿瘤处于生长状态。②Claudin3下调的肿瘤细胞不能进入细胞程度性死亡过程，促进肿瘤的发生和发展〔7〕。而Claudin3与Ecad可能共同参与特定细胞连接与黏附信号的传递，影响细胞迁移，进而促进肿瘤的发生发展。

　　【参考文献】

　　1 王翠芝，周小鸽，黄受方，等.Claudin1在宫颈病变中的表达及其诊断价值〔J〕.诊断病理学杂志，2006;13(5)：3624.

　　2 Van Itallie CM,Colegio OR,Anderson JM,et al.The cytoplasmic tails of claudins can influence tight junction barrier properties through effects on protein stability〔J〕.J Membr Boil，2004;199(1)：29.

　　3 Soini Y.Expression of claudins 1,2,3,4,5 and 7 in various types of tumours〔J〕.Histopathology，2005;46：55160.

　　4 Long H，Crena CD，lee WH,et al.Expression of clostridium perfringens enterotoxin receptors claudin3 and claudin4 in prostate cancer epithelium〔J〕.Cancer Res，2001;61：787881.

　　5 Resnick MB，Cavilanez M，Newton E,et al.Claudin expression in gastric adenocarcinomas：a tissue microarray study with prognostic correlation〔J〕. Hum Pathol，2005;36：88692.

　　6 Delektorskaia VV，Perevoshchikov AG，Golovkov DA,et al. Immunohistochemical study of Ecadherin，betacatenia and CD44v6 expression in the cells of primary colon cancer and its metastases〔J〕. Arkh Patol，2005;67(6)：348.

　　7 王 刚，吴小侯.Claudin3在膀胱移行细胞癌中的表达及意义〔J〕.重庆医学，2009;38(17)：21548.