川芎嗪抗大肠癌sw620裸鼠移植瘤血管生成及抑瘤机制的实验研究

　　作者：李雷宇1，张俊华1，张银旭1，李伟2 作者单位：(1. 辽宁医学院附属一院 普通外科，辽宁 锦州 121000; 2. 辽宁医学院附属一院 中医科，辽宁 锦州 121000)

　　【摘要】 目的:探讨川芎嗪对大肠癌实体瘤及其血管生成的抑制作用与机制。方法: 建立大肠癌sw620裸鼠移植瘤模型，随机分成5组：生理盐水组，川芎嗪低、中、高3个剂量组及恩度组。给药后检测移植瘤的体积和质量，观察移植瘤的病理形态学改变，并分别用免疫组化法和Western blotting法检测移植瘤组织中CD34、VEGF、HIF1α蛋白表达。结果：与生理盐水组相比，川芎嗪中、高剂量组大肠癌sw620移植瘤的体积和质量明显减小,其瘤体内CD34、VEGF、HIF1α的表达明显降低。结论：川芎嗪能抑制大肠癌sw620裸鼠移植瘤的生长，其作用机制可能与改善肿瘤组织的乏氧状况、抑制肿瘤血管生成有关。

　　【关键词】 川芎嗪; 大肠癌; 移植瘤; 血管生成; 小鼠

　　Experimental study on tetramethylpyrazine in antiangiogenesis of colorectal cancer sw620 xenografts in nude mice and its tumorinhibitory mechanism

　　LI Leiyu 1, ZHANG Junhua1, ZHANG Yinxu1, LI Wei2

　　(1. Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121000, China; 2. Traditional Chinese Medicine Division, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121000, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the inhibition effects of tetramethylpyrazine on angiogenesis of solid tumor in mice and its mechanism. Methods: We established the model of colorectal cancer sw620 xenograft in nude mice and randomly divided them into five groups: NS group, low, middle and highdose of tetramethylpyrazine treatment group,and Endostar group. The tumor volume and weight were measured after administration, and the pathological changes in tumors were observed .Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of CD34, VEGF, HIF1α in tumor tissue. Results: Compared with the NS group, the size and weight of colorectal cancer sw620 xenografts in middle and high dose of tetramethylpyrazine treatment group were significantly reduced, and the expression of CD34, VEGF, HIF1α was markedly lower. Conclusion: Tetramethylpyrazine can inhibit colorectal cancer sw620 xenograft growth in nude mice, and its mechanism may be related to the improvement of the status of tumor tissue hypoxia and to the inhibition of tumor angiogenesis.

　　[Key words] ligustrazine; colorectal cancer; xenografted tumor; angiogenesis; mice

　　肿瘤的生长依赖于肿瘤组织中新生血管的形成，抑制肿瘤血管生成就能起到抑制肿瘤的作用。近年来，祖国传统中药在抗肿瘤血管生成方面的研究有了巨大的进展。有研究表明，活血化瘀中药川芎的主要成分川芎嗪具有抑制实体瘤生长的作用，其抗肿瘤机制可能与抑制血管生成有关[1];但其通过何种途径发挥作用尚不完全清楚。本实验研究川芎嗪对大肠癌sw620裸鼠移植瘤血管生成的影响，并探讨可能存在的其他作用与机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　实验动物为BALB/c裸鼠，6～8周龄，雄性，体重18～22 g，购自大连医科大学实验动物中心，SPF实验室饲养，许可证批号为SCXK(辽)20080002。大肠癌sw620细胞株购自百奥迈科生物技术有限公司。盐酸川芎嗪注射液(tetramethylpyrazine，TMP)购自郑州卓峰制药厂，批准文号为国药准字H20055479。重组人血管内皮抑制素注射液(恩度)购自山东先声麦得津制药有限公司，批准文号为国药准字S20050088。鼠抗人VEGF和CD34、HIF1α单克隆抗体购自北京中杉金桥公司。

　　1.2 移植瘤模型的建立

　　培养sw620大肠癌细胞，当细胞融合度达97%时弃掉培养基，采用胰酶消化法消化细胞，将细胞吹打脱壁后吸入离心管内离心，弃上清，按每只裸小鼠皮下接种细胞数2.5×107ml-1，加入PBS液，于裸小鼠腋后方皮下注入0.2 ml，观察其皮肤表面移植瘤成功率。

　　1.3 实验分组

　　将30只荷瘤裸小鼠随机分成5组，每组6只。于接种后第8天时开始成瘤，14 d时开始给药，分组及用药情况如下：(1) 生理盐水组,生理盐水0.2 ml·次-1每日腹腔注射1次，共21次;(2) TMP低剂量组,TMP 50 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次;(3) TMP中剂量组,TMP 100 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次;(4) TMP高剂量组,TMP 200 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次;(5) 恩度组,恩度20 mg·kg-1每日腹腔注射1次,共21次。

　　1.4 一般检测

　　给药后，用游标卡尺测量荷瘤小鼠肿瘤的最长径(a)和最小径(b)，按V=0.5 ab2 计算肿瘤体积，每周测量2次。停药后脱颈处死裸鼠，剥取移植瘤，称瘤重并计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。

　　1.5 HE及免疫组化染色

　　取肿瘤组织，10%甲醛固定、石蜡包理、切片、HE染色，光镜观察。采用免疫组化SABC法检测肿瘤组织CD34以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作，阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。

　　1.6 CD34和VEGF表达的检测

　　免疫组化阳性细胞被染成棕黄色。微血管密度(MVD)计数方法:先在低倍镜(100倍)视野下选取肿瘤微血管最丰富的区域,再在200倍视野范围计数微血管数目,取5个视野的平均值作为CD34的值，肿瘤内硬化和肿瘤细胞稀少区域不进行计数。VEGF表达评分：每组6个标本各1张切片，在200倍视野下随机选择背景和阳性组织区域各5处,染色范围(阳性细胞比率)划分为5级：阴性为0，阳性细胞1%～25%为1， 26%～50%为2，51%～75%为3，76%～100%为4;染色强度划分为4级：阴性为0，弱阳性为1，中等强度为2，强阳性为3。

　　1.7 Western blotting方法检测HIF1α的表达

　　每例标本取肿瘤组织约50 mg，加入细胞裂解液、研磨、离心，考马斯亮兰法测定总蛋白浓度。取总蛋白40 μg，电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭，加入一抗、二抗孵育，BCIP/NBT显色，经自动电泳凝胶成像分析仪对缺氧诱导因子1α(hypoxia inducer factor1, HIF1α)进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带的比值代表目的基因蛋白的表达水平。

　　1.8 统计学处理

　　数据分析采用SPASS 13.0软件，P<0.05视为差异具有统计学意义，数据用 x±s表示,组间、组内比较用单因素方差分析法。

　　2 结 果

　　2.1 川芎嗪对移植瘤生长体积的影响

　　皮下接种后第8天各组裸小鼠皮肤表面开始出现高粱米粒大小的移植瘤，8 d后瘤体生长加快，14 d各组小鼠瘤体的a和b平均达8 mm和8 mm。给药结束后，TMP高剂量组以及恩度组移植瘤生长体积显著低于生理盐水组(P<0.01)，TMP中剂量组移植瘤体积亦低于生理盐水组(P<0.05)，TMP低剂量组移植瘤体积与生理盐水组相比无明显差异(P>0.05)，见图1。

　　2.2 川芎嗪对肿瘤质量及抑瘤率的影响

　　给药结束后,TMP中、高剂量组以及恩度组肿瘤质量显著低于生理盐水组，TMP低剂量组肿瘤质量与生理盐水组相比无明显差异(P>0.05)，见表1。表1 TMP各剂量组及恩度组对sw620移植瘤的抑制作用

　　2.3 移植瘤组织病理学检查及血管形态的比较

　　实验结束后,进行移植瘤组织病理学检查，镜下均可见癌组织，为直肠低分化腺癌，癌细胞呈实性排列，

　　失去正常的腺样结构，癌细胞有明显的异型性，有核分裂像。HE染色显示TMP中、高剂量组及恩度组相对生理盐水组染色血管明显减少，见图2。

　　2.4 移植瘤组织CD34的表达

　　移植瘤内可见形态不规则的血管，血管内皮细胞被褐染，免疫组化染色结果见图3，各组CD34值比较见表2。

　　2.5 移植瘤组织VEGF的表达

　　VEGF主要表达于肿瘤细胞内,阳性染色的肿瘤细胞多位于浸润边缘。免疫组化结果见图4，各组VEGF值比较见表2。

　　2.6 移植瘤组织HIF1α的表达

　　Western blotting检测结果见图5，各组HIF1α值比较见表2。

　　3 讨 论

　　肿瘤生长具有明确的血管依赖性，通过血管从宿主获取营养成分，又经过血管向宿主输送肿瘤细胞，增强肿瘤灶的远处转移能力[2]。当肿瘤体积超过2 mm3时，其继续生长就需要新生血管维持营养供给和排泄代谢产物。如果没有新生血管长入，肿瘤就将保持休眠状态甚至退化[3]。有研究显示，MVD水平与肿瘤的淋巴结转移、浸润深度、TNM分期密切相关[4]。因此，控制血管的生成已经成为抑制肿瘤生长的重要靶点[5]。本研究显示，TMP中、高剂量组可显著降低肿瘤微血管密度，抑制肿瘤血管的形成，并与肿瘤的体积和质量减少密切相关，表明川芎嗪抑制肿瘤的生长可能是通过抑制血管生成实现的，这与既往的报道一致。肿瘤细胞能够分泌多种血管生成因子,其中VEGF是高效、高特异性作用于血管内皮的促血管生成因子[6]。

　　大量实验证实VEGF是肿瘤中发现的最重要的血管生成因子[7]，肿瘤细胞原癌基因突变或肿瘤组织中缺氧因素均可诱导其产生，Schoppmann等[8] 分析发现，HIFlα与VEGF显著相关，HIFlα表达增加可使肿瘤血管形成因子VEGF表达升高[9-10]。因此，HIFlα是缺氧状态下血管生成的核心调控因子，通过影响VEGF的表达，可直接参与血管生成的全过程[11]。研究结果显示，TMP中、高剂量组VEGF、HIF1α表达均显著降低，且有一致性，二者与肿瘤血管生成的减少亦相关。这一结果提示，川芎嗪可能是通过抑制HIF1α的表达，进而使VEGF表达降低，最终起到抑制血管生成的作用。

　　许多实体肿瘤都具有缺氧的微环境，肿瘤细胞对缺氧的自身调节和适应机制主要是通过新生血管形成实现的。因此，如果改善了肿瘤组织的乏氧环境，就有可能抑制新生血管的形成，从而延缓和抑制肿瘤的生长[12]。中医的活血化瘀法是治疗肿瘤的重要方法之一，其抑瘤的靶点与多种因素有关[13]，但尚未见到有关改善组织乏氧、抗实体瘤血管生成的报道。本研究表明，活血化瘀药川芎嗪可以抑制肿瘤的生长，其机制可能与活血化瘀药可以改善肿瘤组织血流变、消除微循环障碍、缓解肿瘤的乏氧状态有关，从而使HIF1α表达减少、VEGF表达降低，进而减少肿瘤血管的生成，恢复机体正常的微环境，最终达到抑制肿瘤的目的。但除此之外，活血化瘀药川芎嗪抑制肿瘤的生长及血管生成是否与改善其他肿瘤微环境因素有关尚不完全清楚，有待进一步研究。

　　【参考文献】

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