ATP生物荧光肿瘤体外药物敏感性检测在乳腺癌中的应用

　　作者：张涛 作者单位：100021 北京，中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤医院腹部外科

　　【摘要】 目的 评价ATP生物荧光肿瘤体外药物敏感性检测结果是否能真实反映肿瘤的药敏情况以及该方法指导制定化疗方案的可行性。 方法 应用ATP生物荧光肿瘤体外药物敏感性检测法，检测42例乳腺癌标本对12种常用药物的敏感性。 结果 标本的可评价率为95%，乳腺癌对PTX最敏感，体外有效率为93%，其次为ADM(67%)和5Fu(64%)，体外有效病例中强敏感病例比例最高的为PTX，达到69%，其次为ADM(61%)和5Fu(56%)，检测结果与临床疗效相符。ER/PR、PCNA、p53、cerbB2、绝经与否、淋巴结转移与否与药物是否有效无关。 结论 ATP生物荧光肿瘤体外药物敏感性检测法敏感性高、稳定性好、简便、快速，检测结果真实可信，可用于临床制定个体化的化疗方案。

　　【关键词】 药物敏感性试验 ATP生物荧光法 乳腺癌

　　以个体化治疗为目的的肿瘤药物敏感性检测是目前肿瘤研究的主要课题之一，其检测方法有很多种，美国国立卫生研究院妇科肿瘤学研究组认为三磷酸腺苷(ATP)生物荧光肿瘤体外药物敏感性检测法(ATP bioluminescence ex vivo tumor chemosensitivity assay, ATPTCA)是最有发展前途的一种药敏试验方法[1]。本文采用该方法检测42例乳腺癌标本，探讨应用该方法指导进行乳腺癌个体化治疗的可行性。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料

　　2002年7月～2003年7月乳腺癌住院手术患者，术中取新鲜肿瘤标本共42例，患者年龄31～65岁，平均46岁;绝经前24例，绝经后18例;I期4例，IIa期30例，IIb期8例;浸润性导管癌25例，浸润性小叶癌5例，髓样癌6例，导管内癌6例;腋窝淋巴结有转移23例，无转移19例。

　　1.2 仪器及试剂

　　51H二氧化碳细胞培养箱(Fisher Scientific)，MPL1荧光测定仪(Berthold)，ATP生物荧光肿瘤药物敏感性检测试剂盒(北京金紫晶生物医药有限公司)。

　　选取目前常用药物共12种，其血浆峰值浓度(Peak plasma concentration, PPC)分别为：紫杉醇(PTX)2.2μg/ml，阿霉素(ADM)0.5μg/ml，5氟尿嘧啶(5Fu)50μg/ml，顺铂(DDP)2.5μg/ml，表阿霉素(EPI)0.78μg/ml，羟基喜树碱(HCT)1.6μg/ml，诺维本(NVB)1μg/ml，丝裂霉素(MMC)0.23μg/ml，健择(GEM)25μg/ml，足叶乙甙(VP16)20μg/ml，氨甲喋呤(MTX)1.5μg/ml，拓扑替康(TPT)0.7μg/ml。

　　1.3 试验方法

　　新鲜肿瘤组织剪成0.5～1mm3碎块,　置于50ml离心管中，加入10ml含组织消化酶的培养基，放入37℃培养箱中，消化2～3h后过滤，得到单细胞悬液，而后400g离心10min后吸除上清液，用培养基洗涤1次，若有明显红细胞沉淀则需要进行去除红细胞的操作，最后调整细胞浓度为2×105～4×105个细胞/ml。

　　取单细胞悬液，接种于96孔培养板，2×105～4×105个细胞/孔，加入抗肿瘤药物(X组)，每种药物设6个测试浓度，每个浓度设3个平行孔，这6个浓度分别为PPC的2倍、1倍、0.5倍、0.25倍、0.125倍、0.0625倍;另外还要设2个对照组，一个不加任何药物(M0组)，一个加入ATP抑制剂(Mi组)，每组设12个平行孔。

　　培养板在37℃，5%　CO2饱合湿度培养6天后，各孔加ATP提取液50μl，孵育5min，吸取50μl加入荧光测定板中，加入50μl ATP检测液，置荧光测定仪上测量各孔在560nm波长处的荧光强度，计算出平均值。

　　1.4 结果判定

　　抑制率=[1-(X-Mi)/(M0-Mi)]×100%

　　注：X, M0, Mi为荧光强度

　　抑制率可用荧光测定仪自带软件计算，并进一步计算出杀伤50%、90%肿瘤细胞所需药物浓度IC50和IC90。

　　根据Kurbacher等[2]的标准，将药物对肿瘤的作用分为4个级别：

　　强敏感(SS)：IC50≤25% PPC和IC90<100% PPC

　　中度敏感(IS)：IC50≤25% PPC和IC90≥100% PPC

　　轻度敏感(MS)：IC50>25% PPC和IC90<100% PPC

　　耐药(R)：IC50>25% PPC和IC90>100% PPC

　　体外有效=SS+IS

　　体外无效=MS+R

　　1.5 统计学处理

　　应用统计软件SPSS 10.0完成统计分析。

　　2 结果

　　42份标本中2份检测失败，样品的可评价率为95%，2例失败的病例，1例因为细菌污染而放弃检测，另1例因为细胞数量少而无法完成检测。

　　12种药物的体外有效率为：PTX 93%，ADM 67%，5Fu 64%，MMC 50%，HCT 50%，GEM 45%，DDP 43%，NVB 43%，MTX 40%，EPI 36%， VP16 29%，TPT 24%。

　　各药物体外有效病例中强敏感病例比例为：PTX 69%，ADM 61%，5Fu 56%，MMC 48%，HCT 40%，GEM 33%，DDP 30%，NVB 29%，MTX 28%，EPI 25%， VP16 25%，TPT 22%。

　　不同临床因素中各药物体外有效例数, 见表1。经卡方检验可知ER/PR、PCNA、p53、cerbB2、绝经与否、淋巴结转移与否与药物是否有效无关(P>0.05)。

　　3 讨论

　　肿瘤个体化治疗是发展趋势，为了在化疗前明确肿瘤对何种药物敏感，人们建立了多种体外药敏方法，但这些方法均未在临床上广泛应用。1983年Moyer等[3]提出内源性ATP的数量可以反映细胞的活性度，随后Kangas等[4]、Kuzmits等[5]等相继证实ATP生物荧光技术是一种敏感而可靠的确定各种细胞活性的检测方法，1988年Sevin等[6,7]将ATPTCA应用于卵巢癌的治疗，认为该方法具有敏感性高、稳定性好、快捷、简便、可定量检测等优点。这些优点在本研究中得到了体现，试验中检测标本42例，成功40例，标本可评价率为95%，高于其他方法，ATP检测过程约需30分钟，而其他方法需孵育1～4小时;本试验可对检测物进行定量分析，较准确，避免了人为因素干扰。ATPTCA所需标本量较少，本研究检测12种药物，取材大小为1　cm3，完全可以满足检测的需要，因此对于早期肿瘤、复发及转移瘤，能提供的标本量较小，更适于应用此方法。

　　研究表明ATPTCA药敏结果与临床疗效具有较好的相关性，可用于制定个体化化疗方案。1993年Koechli等[8]报道在乳腺癌化疗中，ATPTCA结果的阳性预测值为90%，阴性预测值为86%，整体预测精确性为85%。2003年Kurbacher等[9]报道表1 不同临床因素中各药物体外有效例数了ATPTCA指导卵巢癌和乳腺癌化疗的临床II期试验结果，表明ATPTCA指导下进行化疗极大提高了疗效，延长生存期，与传统化疗模式比较差异极为显著(疗效为75% vs 35%，总生存期为28.5月 vs 14月，P<0.0001)，目前III期试验正在进行，进一步评价ATPTCA在指导化疗中的价值。

　　在本研究中常用化疗药物的体外有效率是较高的，12种药物中5种药物的体外有效率超过50%，不论是体外有效率还是强敏感病例比例，最高的为PTX，其次为ADM和5Fu，这表明这3个药对大多数患者有效，且患者多数为强敏感，这与临床见到的药物疗效基本一致，可见ATPTCA的检测结果与临床疗效是相符的，可以根据检测结果制定化疗方案。由表1可知ER/PR、PCNA、p53、cerbB2、绝经与否、淋巴结转移与否这6种临床因素与药物有效率无关，目前尚不能根据几个临床指标来判断患者对哪种药物敏感，临床用药尚停留在经验治疗水平上，ATPTCA将为制定化疗方案提供客观依据，使治疗个体化。

　　总之，在ATPTCA指导下进行化疗使治疗有的放矢，避免患者进行无效化疗，为实现个体化治疗的目标和设计新的联合化疗方案提供了技术支持，具有广阔的应用前景。

　　【参考文献】

　　[1] Sevin BU, Perras JP, Averette HE, et al. Chemosensitivity testing in ovarian cancer[J]. Cancer, 1993,71(4　supp):16131619.

　　[2] Kurbacher CM, Cree IA, Bruckner HM, et al. Use of an ex vivo ATP luminescence assay to direct chemotherapy for recurrent ovarian cancer[J]. Anticancer Drugs, 1998,9(1):5157.

　　[3] Moyer JD, Henderson JF. Nucleoside triphosphate specificity of firely luciferase[J]. Anal Biochem, 1983,131(1):187189.

　　[4] Kangas L, Gronroos M, Nieminen AL. Bioluminescence of celluar ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro[J]. Med Biol, 1984,62(6):338343.

　　[5] Kuzmits R, Aiginger P, Muller MM, et al. Assessment of the sensitivity of leukaemic cells to cytotoxic drugs by bioluminescence measurement of ATP in cultured cells[J]. Clin Sci(Lond), 1986,71(1):8188.

　　[6] Sevin BU, Peng ZL, Perras JP, et al. Application of an ATPbioluminescence assay in human tumor chemosensitivity teting[J]. Gynecol Oncol, 1988,31(1):191204.

　　[7] Sevin BU, Perras JP. Tumor heterogeneity and in vitro chemosensitivity testing in ovarian cancer[J]. Am J Obstet Gynecol, 1997,176(4):759766.

　　[8] Koechli OR, Avner BP, Sevin BU, et al. Application of the adenosine triphosphatecell viability assay in human breast cancer chemosensitivity testing: a report on the first results[J]. J Surg Oncol, 1993,54(2):119125.

　　[9] Kurbacher CM, Grecu OM, Stier U, et al. ATP chemosensitivity testing in ovarian and breast cancer: early clinical trials[J]. Recent Results Cancer Res， 2003,161(2):221230.