白术对小鼠移植性肉瘤S180的抑瘤作用及对Bcl2基因表达的影响

　　作者：邱根全，赵云，刘昳，蔡云 邱根全 作者单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院中医科，陕西西安 710061;2. 安徽省宣城市中心医院消化内科，安徽宣城 242000

　　【摘要】 目的 探讨白术对小鼠S180肉瘤的抑制作用及对肿瘤凋亡相关基因Bcl2表达的影响。方法 昆明系小鼠60只，皮下注射S180细胞，同时分别给予白术、环磷酰胺处理小鼠，其后2周内测量各组肿瘤生长大小;采用RTPCR法检测凋亡抑制基因Bcl2的表达。结果 白术组的肿瘤重量低于模型组而大于环磷酰胺组(P均<0.05)，但白术抑制肿瘤生长的作用强度未呈现量效关系，且其抑瘤率不及环磷酰胺(P<0.05);与对照组相比，白术能显著抑制肿瘤Bcl2基因的表达水平(P<0.05)。结论 白术具有抑制肿瘤生长的作用，可作为肿瘤治疗的辅助药物。

　　【关键词】 白术;S180肉瘤;Bcl2

　　Baizhu suppresses S180 sarcoma growth and inhibits

　　Bcl2 expression in tumortransfected mice

　　QIU Genquan, ZHAO Yun, LIU Yi, CAI Yun

　　1. Department of Chinese Medicine, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Department of Internal Medicine,Xuancheng Central Hospital, Xuancheng 242000, China

　　ABSTRACT: Objective To study Baizhus inhibitory effect on S180 sarcoma growth and its effect on Bcl2 expression in tumortransfected mice. Methods S180 cells were subcutaneously injected into 60 healthy Kunming mice. Meanwhile the mice were dealt with MTX or Baizhu, separately; the weight of tumor was measured in the following two weeks; the expression of Bcl2 was detected by RTPCR. Results The tumors weight in Baizhu group was lower than that in model group, but higher than in MTX group (P<0.05), but Baizhus inhibition was not associated with its dose (P>0.05), and Baizhus rate of tumor growth inhibition was lower than that of MTX. Compared with that in control group, Bcl2 expression was lower in Baizhu group obviously. Conclusion Baizhu can inhibit tumor growth and serve as an adjuvant drug in tumor therapy.

　　KEY WORDS: Baizhu; S180 sarcoma; Bcl2

　　近年来大量研究证实，中医药学在肿瘤防治方面具有不可替代的优势。中药白术的抗肿瘤作用已有很多报道，其作用机制亦涉及多个方面[1]。本研究通过建立移植性S180肉瘤实体小鼠模型,观察中药白术的抑瘤作用，并从RNA水平观察白术对肿瘤凋亡相关基因Bcl2表达的影响，以期对白术的抑瘤机制做更深一步的探讨。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及瘤株

　　健康的昆明系小鼠(雌雄各半，6～7周龄)60只，体重20g左右。肿瘤细胞株：S180肉瘤，腹水型，购自西安交通大学医学院肿瘤研究中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 S180荷瘤小鼠模型及中药白术煎剂的制备

　　S180肿瘤细胞复苏、种植传代，待传代至第7天，肿瘤生长旺盛时，缓缓抽出约4～5mL的乳白色血性液体，加入3倍的无菌生理盐水稀释，迅速离心，制成2×106/mL的细胞悬液。小鼠右前肢靠近腋下部，皮下注射瘤细胞悬液约0.2mL，制成局灶型肿瘤模型。

　　取中药白术饮片至煎煮器皿中，加入相当于生药材5倍的冷水浸泡1h，煮沸30min，过滤，药渣加3倍的水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于60℃水浴中浓缩为相当于原生药材1g/mL的药液，冷却装入灭菌药瓶，至4℃冰箱保存备用。用时按要求分别稀释为1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL。

　　1.2.2 分组及给药

　　60只小鼠随机取10只作为空白对照组，其余50只接种肿瘤细胞株24h后，再随机分为：模型组，环磷酰胺组，白术大、中、小剂量组5组，每组10只。白术各剂量组分别给予白术水煎剂(5g/kg、10g/kg、20g/kg)灌胃，模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续10d。

　　1.2.3 肿瘤的提取

　　在动物接种瘤细胞的第11天，末次给药后24h，称体重，颈椎脱臼处死，完整剥离肿瘤组织并除去血污、脂肪、肿瘤新生血管、被膜等非肿瘤组织。用电子天平称重，计算各组瘤体的平均重量，以给药组瘤重与对照组比较，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。

　　1.2.4 Bcl2基因表达的检测

　　Bcl2引物为上游：5′ACCTGAACCGGCACCTGC3′，下游：5′GGGGCAGGCATGTTGCT3′;内参Betaactin引物为上游：5′CCAGAGCAAGAGAGGCATCC3′，下游：5′CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG3′。引物均在上海生物公司合成。组织总RNA提取按照Trizol(Qiagen, USA)试剂盒说明书的操作步骤，按5mg组织/mL Trizol的比例提取组织总RNA;按照逆转录试剂盒(MBI, USA)说明书在20μL的反应体系中合成细胞总cDNA;PCR反应体系为50μL，内含模板2μL、Taq酶5u(TAKARA, Japan)、目的引物各1μL，补足至50μL。反应条件除退火温度外均为预变性94℃ 4min，变性94℃ 30s，退火30s，延伸72℃ 30s，25个循环数。退火温度Bcl2为57℃，Betaactin为57.5℃，扩增后片段长度分别为197bp、475bp。配制15g/L琼脂糖凝胶，加入0.5mg/L的溴化乙锭(EB);取5mL RTPCR终产物及DNA Marker，以0.5×TBE为缓冲液，电压100V，电泳40min;紫外检测仪下观察DNA的扩增情况;用ImageMaster VDS扫描分析仪扫描凝胶图谱;用100bp梯度的PCR Marker作分子量参照，采用Total Lab2.0分析系统对PCR产物进行半定量分析;测量区带密度,计算样品区带与Betaactin区带的密度比，计算两者比值作为目的基因的相对表达量。

　　1.2.5 统计学处理

　　采用SPSS13.0软件进行统计学处理。实验数据以均数±标准差表示，计量资料组间显著性检验采用方差分析，P<0.05被认为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 小鼠的一般情况

　　1周后模型组小鼠出现明显的生理变化：毛发稀松发灰且干涩、精神不振、喜欢群聚、畏寒状、动作迟缓、饮食较差，且至实验第8、9、10天分别死亡1只，有肉瘤破溃伴有腹水形成;环磷酰胺组状况较模型组好，但亦有少毛、脱毛、精神不振、懒动等情况，第8天死亡1只，无肉瘤破溃及腹水形成;白术各剂量组未出现生理异常、死亡及明显腹水。

　　2.2 白术对小鼠S180肉瘤重量的影响

　　与模型组相比，白术各剂量组和环磷酰胺组的肿瘤重量显著减小(P均<0.05)，但白术各剂量组之间无显著性差异(P>0.05);环磷酰胺组与白术各组之间的肿瘤重量亦有差异(P<0.05)。环磷酰胺组抑瘤率达到65.42%，白术各剂量组达到40%～50%，与环磷酰胺有一定差距，但白术各组之间抑瘤率没有明显差异(表1)。表1 白术对小鼠S180肉瘤重量的影响(略)

　　2.3 各组肿瘤组织中Bcl2基因的表达情况

　　与模型组比较，白术各组肿瘤组织中Bcl2基因的表达明显降低(P<0.05)，且Bcl2基因表达量与剂量呈负相关，即随着白术剂量增加，Bcl2表达量呈下降趋势，但3个不同剂量组之间没有明显的统计学差异(P>0.05);白术组与环磷酰胺组相比，Bcl2表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05);环磷酰胺组与模型组之间Bcl2表达则没有统计学意义(P>0.05，图1)。

　　3 讨 论

　　白术是菊科苍术属药用植物的干燥根茎，主产于浙江省东阳、新昌、天台等地，具有健脾益气、燥温利水、固表止汗、和中安胎、提高免疫功能等作用，被《神农本草经》列为上品，现代临床广泛用于肿瘤的治疗并取得肯定的疗效。邱氏等[2]认为白术具有抗突变作用;孙氏[3]认为白术有降低肿瘤细胞的增殖率、减低肿瘤组织的侵袭性、提高机体抗肿瘤反应能力及对肿瘤细胞的细胞毒性作用;朱氏[4]认为白术具有抑制肿瘤生长作用可能与其调节免疫作用有关，尤其是与细胞免疫有关，并且这种作用呈一定的剂量关系;郑氏[5]认为白术抑制肿瘤作用与其提高凋亡诱导基因的表达，降低凋亡抑制基因的表达有关。前期大量的实验报道、中药白术具有抗肿瘤作用，对其作用机制亦有不同层次、不同方面的广泛研究。本研究结果显示，白术具有抑制肿瘤生长的作用，效果虽较环磷酰胺低，但其对荷瘤小鼠的生存数及体重没有明显的影响。蔡氏等[6]研究认为白术水煎剂有提高恶病质小鼠体重，明显阻止癌性恶病质鼠体重下降的作用。刘玉英等[7]研究亦表明白术能改善荷瘤小鼠体质，增强小鼠的免疫功能，这与中医中白术作为补益药是相吻合的。至于剂量与这种作用之间的量效关系，从本次实验结果看来，在改善荷瘤小鼠体质方面没有明显差别。

　　Bcl2为肿瘤凋亡抑制基因，在多种肿瘤中都发现其高表达。白术能降低肿瘤细胞凋亡抑制基因Bcl2的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡，这是其抑瘤作用的机制之一。中医认为疾病的产生取决于邪正双方的对比，正胜则邪退，邪胜则正退。肿瘤的发生与机体脏腑功能失调，气血虚弱有关。中药白术有健脾之功，脾的健运正常，气血化生有源，则正气旺盛以达抑制肿瘤生长的作用，这可能是白术能显著降低Bcl2基因表达而发挥抗肿瘤作用的基础。肿瘤的发生，并非某一单一因素所为。细胞凋亡是现在肿瘤研究的热点之一，而相关基因亦较多，如Bcl2、cmyc、survivin、野生型p53、bax基因等。环磷酰胺是经典的抗肿瘤药物之一。现代药理揭示其通过细胞毒及免疫抑制作用而发挥抗肿瘤作用。在本研究中，磷酰胺组中瘤重、抑瘤率与其他各组相比均有显著差异，但对肿瘤相关基因Bcl2的表达则没有明显抑制作用，这可能与选择的肿瘤、基因种类有关。关于环磷酰胺是否具有调节肿瘤相关基因表达而发挥抗肿瘤作用，尚有待于深入研究。

　　目前，西药中的抗肿瘤药物很难同时兼顾细胞凋亡过程中的各个因素，因而对肿瘤的治疗亦有其不尽人意之处。中医药的抗肿瘤作用具有多层次、多靶点特点，而中医复方的抗肿瘤研究更能体现中医的特色。因此，进一步研究白术复方的抗肿瘤作用及其机制才能更好地发挥其在肿瘤治疗方面的优势。

　　【参考文献】

　　[1]王翕，刘玉瑛，史天良. 白术挥发油抗实体瘤的作用研究 [J]. 中国药物与临床, 2002, 2(4):239240.

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　　[4]朱庆均，郑广娟，张丹. 白术水提物抑瘤作用及其机制研究 [J]. 山东中医药大学学报, 2006, 30(1):5658.

　　[5]郑广娟. 白术对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用及肿瘤凋亡相关基因bcl2表达的影响 [J]. 生物医学工程研究, 2006, 7(2):3233.

　　[6]陈熠. 肿瘤中医证治精要 [M]. 上海:上海科技出版社, 2007:5783.

　　[7]蔡云，孙烨. 白术挥发油对癌性恶病质小鼠血清细胞因子TN F2A、IL 22的影响 [J]. 陕西中医, 2006, 27(11):3334.