索拉非尼防治大鼠肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的研究

　　杨振林　邹伟伟　 作者单位：256603　山东省，滨州医学院附属医院甲状腺乳腺外科

　　【摘要】 目的　探讨索拉非尼防治大鼠肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的作用。方法　Walker-256癌细胞于Wistar大鼠门静脉注射，模拟大鼠肝癌肝移植术后肿瘤转移复发模型，术后随机分为4组(每组16只)：A组(对照组);B组(索拉非尼低剂量组);C组(索拉非尼中剂量组);D组(索拉非尼高剂量组)，另选取E组(n=8)正常大鼠作为正常组。实验组、对照组分别于术后20 d各处死8只，并同时处死正常组8只大鼠，取大鼠肝脏、肺组织，常规甲醛固定、制作石蜡切片，常规进行镜下观察;免疫组织化学方法检测肝脏、肺组织血管内皮生长因子(VEGF)及微血管密度(MVD)，并对大鼠肝脏VEGF阳性率及MVD值行双变量相关性分析;对索拉非尼各剂量组及对照组剩余8只大鼠，观察其生存时间。结果　索拉非尼各剂量组及对照组大鼠肝脏均出现了肿瘤转移复发，肺内均未见肿瘤转移，但索拉非尼各剂量组大鼠肝脏癌灶坏死程度较对照组轻，癌灶周边肝脏细胞受累坏死程度较对照组轻;索拉非尼各剂量组大鼠肝脏VEGF阳性率、MVD计数小于对照组(P<0.01)，肝脏VEGF与MVD高度相关(rp=0.84，P<0.01);对照组、索拉非尼各剂量组大鼠肺组织VEGF、MVD差异无统计学意义(P>0.05);索拉非尼中、高剂量组大鼠生存时间长于对照组(P<0.05)。结论　索拉非尼可以抑制肝癌肝移植术后大鼠肝脏内VEGF合成，降低了肝脏内癌灶MVD、抑制癌灶微血管生成，同时减轻了癌灶对正常肝细胞的损害作用，延长了肝癌肝移植术后大鼠生存时间，对防治大鼠肝癌移植术后肿瘤转移复发起到一定作用。

　　【关键词】 肝肿瘤;　肝移植;　肿瘤复发，局部;　血管内皮生长因子类;　索拉非尼

　　【Abstract】　Objective　To investigate the prevention and treatment of tumor recurrence with Sorafenib after orthotopic liver transplantation (OLT) for primary carcinoma of liver in rats. Methods　 Portal vein injection of Walker-256 cancer cells to establish models of metastasis and recurrence of liver after liver transplantation in rats. The rats were randomly divided into 4 groups(n=16)：Control group (group A); Sorafenib low-dose group (group B); Sorafenib medium-dose group (group C); Sorafenib high-dose group (group D);moreover， a normal group (group E， n=8). Eight rats of each group were chosen 20 days after operation to have observation of pathological changes in liver， which were made with hematoxylin-eosin sectioning (HE);vascular endothelial growth factor (VEGF) and microvessel density (MVD) level of liver and lung tissues were detected by immunohistochemistry; bivariate correlation analysis of VEGF and MVD of liver were used to identify the relationship between them;survival time of remaining 8 rats from control group and experimental groups of Sorafenib were observed. Results　There were no differences in tumor metastasis and recurrence among control group and Sorafenib experimental groups， for it could be found metastasis and recurrence in rat liver of each group， no cancer metastasis or recurrence found in lung of each group， however， Sorafenib experimental groups had signifcantly higher ratio of cancer cell apoptosis， lower ratio of necrosis of liver cells compared with control group; VEGF-positive ratio and MVD counts of liver in each experimental group were smaller than that of control group (P<0.01);VEGF and MVD in liver were highly correlated(P<0.01)， correlation coefficient rp=0.84;there was no difference of VEGF and MVD in lung tissue of each group(P>0.05);survival rate of medium-dose group and high-dose group were higher (P<0.05). Conclusions　Sorafenib could inhibit synthesis of VEGF in tumor tissue， which could inhibit angiogenesis of tumor， then tumor growth， as well as invasion to normal liver cells were inhibited， and liver function damage was slighter， survival time were prolonged. As a result， there was a positive therapeutic effect of application of Sorafenib after orthotopic liver transplantation (OLT) for primary carcinoma of liver in rats.

　　【Key words】　Liver neoplasms;　Liver transplantation;　Neoplasm recurrence， local;　Vascular endothelial growth factors;　Sorafenib

　　肝移植用于治疗原发性肝癌(HCC)及其合并的肝硬化效果确切，但肝移植术后患者长期生存状况并不十分理想，主要是由于肝癌有较高的复发率[1]。肝癌是血供丰富的恶性肿瘤，有研究表明，肿瘤新生血管在肿瘤的生长、转移、复发中起到了重要作用[2]，因此，通过抑制肿瘤血管生成有可能成为防治肝癌肝移植术后肿瘤转移复发的有效方法。因此，本实验采用抗血管生成药物索拉非尼，探讨其在防治大鼠肝癌肝移植术后肿瘤转移复发中的作用及机制。

　　材料与方法

　　一、材料

　　SPF级Wistar大鼠72只，雄性，200～230 g;Wistar幼大鼠4只，雌性，80～100 g;均购于山东中医药大学[动物合格证号：SCXK(鲁)20050015]。Walker-256癌细胞，购于中国典型培养物保藏中心;索拉非尼： 德国拜耳医药保健股份公司，每片200 mg，60片/盒，批号H20060296;兔抗鼠血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);兔抗鼠CD34多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);RPMI1640培养基(赛默飞世尔生物化学制剂有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。

　　二、方法

　　1. 大鼠肝癌肝移植后肿瘤转移复发模型的制作：参照文献[3]报道方法并加以改进：Walker-256癌细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养、传代至对数期，取1 ml(细胞计数约1.5×107/ml)注入Wistar幼大鼠腹腔。1周后抽取癌性腹水，离心，弃上清，取下层黏稠细胞悬液，PBS重悬，细胞计数1×107/ml，吸入 1 ml注射器;Wistar大鼠3% 水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，消毒后，取上腹正中切口，充分显露门静脉，针尖呈30°斜行刺入门静脉约0.5 cm，注射癌细胞悬液 0.5 ml，拔针后压注射点至无渗血后逐层关腹。

　　2. 分组及给药：术后大鼠随机分为4组(每组16只)：A组：对照组，术后第2天开始每天蒸馏水1 ml 灌胃，连续灌胃20 d;B组：索拉非尼低剂量组，术后第2天开始每天索拉非尼水溶液1 ml灌胃，剂量为10 mg/kg，连续灌胃20 d;C组：索拉非尼中剂量组，剂量为50 mg/kg，连续灌胃20 d;D组：索拉非尼高剂量组，剂量为100 mg/kg，连续灌胃20 d;另选取E组(n=8)正常大鼠作为正常组。

　　3. 大鼠肝、肺组织病理学观察及VEGF、微血管密度(MVD)检测：灌胃20 d后，对照组及索拉非尼各实验组均随机选取8只大鼠，同时处死正常组8只大鼠，取肝脏、肺组织，制作石蜡切片，镜下观察肝脏、肺组织肿瘤转移复发情况及癌灶坏死情况、周围正常细胞变性坏死程度;采用免疫组织化学SABC三步法检测大鼠肝、肺组织中VEGF、MVD，具体操作方法严格按照说明书进行。VEGF阳性判定标准及计数参照有关文献[4]：细胞质内出现棕黄色颗粒状染色为阳性， 在高倍镜(×200)下对每张切片随机选取5个视野， 每个视野计数200个细胞， 共计1000个， 计算阳性细胞的百分数;MVD计数参照Weidner[5]报道方法：先在低倍镜(×100)下观察全部视野，选取肿瘤血管密度最高的区域，然后在高倍镜(×200)下计数5个视野内微血管数。任何染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇， 就作为1个微血管，取其平均值作为MVD值;对大鼠肝脏VEGF与MVD值行双变量相关性分析。

　　4. 生存分析：对索拉非尼各实验组及对照组剩余8只大鼠进行为期60 d 的观察，记录其生存时间。

　　三、统计学处理

　　实验数据采用统计软件SPSS 13.0进行分析。计量资料采用均数±标准差(x-±s)表示;组间比较采用单因素方差分析;双变量相关性分析采用Pearson相关性分析方法;生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

　　结　　果

　　1. 造模情况：术后20 d，对照组及索拉非尼各剂量组大鼠肝脏肉眼均见肿瘤转移复发，肝脏明显增大，表面大小不等灰白色颗粒状肿瘤组织，弥漫性分布于整个肝脏;镜下见明显异形性肿瘤细胞，瘤细胞间形态差异较小，呈团灶样分布，散布于肝小叶之间，被侵犯的肝脏组织被不同程度破坏，尤其是对照组大鼠，癌灶周边肝细胞破坏明显，正常肝小叶结构消失，周围肝细胞坏死、纤维化明显;索拉非尼各剂量组大鼠肝脏可见癌灶不同程度坏死，周围肝细胞坏死程度较对照组轻，尤以索拉非尼高剂量组明显(图1);对照组及索拉非尼各剂量组大鼠肺组织肉眼及镜下均未见明显转移癌灶。

　　2. 大鼠肝脏VEGF、MVD：对照组大鼠肝脏VEGF阳性率明显增高，部分区域细胞呈弥漫性表达，明显高于索拉非尼各剂量组(P<0.01);索拉非尼各剂量组VEGF表达相对减少，尤其是高剂量组，表现为瘤旁组织少量细胞胞质出现棕色染色(图2)。索拉非尼各剂量组MVD均低于对照组(P<0.01)(图3)，中、高剂量组尤为明显(图4)。

　　3.大鼠肝脏VEGF、MVD相关性分析：对索拉非尼各剂量组及对照组大鼠肝脏VEGF值与MVD值行双变量相关性分析(图5)，其相关系数rp=0.843，P<0.01，表明肝脏VEGF与MVD呈高度正性相关。

　　4.大鼠肺组织VEGF、MVD：对正常组、对照组、索拉非尼各剂量组大鼠肺组织VEGF、MVD结果行单因素方差分析，差异无统计学意义(P>0.05)(图6,7)。

　　5.索拉非尼对大鼠生存状况的影响：对索拉非尼各剂量组及对照组剩余8只大鼠进行为期60 d的观察，记录各组大鼠死亡时间，生存率的比较采用Kaplan-Meier法(图8)。与对照组相比，索拉非尼低剂量组大鼠生存时间差异无统计学意义(P>0.05)，索拉非尼中、高剂量组大鼠生存时间明显延长，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　讨　　论

　　HCC是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，死亡率在所有恶性肿瘤中居第三位。HCC多发生于慢性肝脏病变基础之上，如酒精性肝硬化、病毒性肝炎、代谢性疾病、黄曲霉素感染等。肝移植对HCC的治疗效果确切：既完整切除了肝癌病灶，又治愈了合并的肝硬化等慢性肝病，但长期效果并不理想，主要是肝癌肝移植术后肿瘤转移复发率较高。Yedibela等[1]的统计显示，HCC肝移植术后5年的生存率和再发率分别为18%和39%，其中84%的患者在移植术后2年内再发;Klintmalm等[6]报道的422例中1年、5年生存率分别为72%和44%，肿瘤复发率局限在25%～30%，其复发模式为：移植肝62%、肺56%、骨髓18%。复发的主要原因包括：(1)术前可能存在的肝外转移及血中残存微转移灶复发;(2)术后免疫抑制剂的长期使用削弱了机体免疫功能，增加了肿瘤复发或新发的机会;(3)术后缺乏有效的特异性抗癌手段。

　　Folkman[7]于1971年首次提出肿瘤生长过程中存在两个阶段：血管前期和血管期，当肿瘤聚集体生成后即进入血管前期，此期肿瘤通过弥散作用获得足够的营养和氧气，运走代谢产物;当肿瘤体积增至2～3 mm3 时，如果没有新生血管长入，肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化，一旦血管长入肿瘤，肿瘤将呈快速生长并达到难以控制的体积[8-9]。肿瘤血管生成还是肿瘤转移、复发的关键步骤，因为肿瘤新生血管不成熟，结构缺乏完整性，缺乏细胞间连接，管壁薄弱，仅排列一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基底膜不完整，因此穿透性较高[10]，为肿瘤细胞转移提供了通道。研究表明，肿瘤血管生成是促进血管生成因素和抑制血管生成因素间失衡的结果[11]。

　　VEGF是目前发现的促进血管生成的最重要的因子，因其作为预测肝移植术后肿瘤转移复发的重要因素备受重视[12]。VEGF可以特异性地作用于血管内皮细胞，促进血管生成，在肿瘤的生长、转移中起到重要作用，VEGF及其受体在肝癌组织中较正常肝组织表达高，增多的 VEGF 主要来源于肿瘤细胞和肝星状细胞旁分泌和自分泌[13]。MVD是反映肿瘤血管生成的有代表性的指标[14]，与肿瘤的血供、氧供、增殖、侵袭、转移密切相关[15]，已成为一项预测肿瘤转移、复发和判断预后的重要指标[16-17]。本实验中，通过对大鼠肝脏VEGF与MVD行相关性分析，证实了大鼠肝脏VEGF与MVD呈高度正相关，它们在对照组大鼠肝脏组织中的表达明显高于正常组，提示肝内癌灶在生长过程中促进了VEGF的大量分泌，VEGF与其受体特异性结合后，加速了血管内皮增殖分化，促进血管生成，从而为肿瘤的生长提供所需的氧及营养物质，促进了肿瘤的生长和转移复发。研究报道，VEGF的过度表达是肿瘤转移复发的高危因素，早期出现转移复发的患者存在VEGF的过高表达[18-19]。本实验中，虽然对照组及索拉非尼各剂量组大鼠肝脏均出现了转移复发，但对照组大鼠肝脏的病变程度明显重于索拉非尼各剂量组，对照组大鼠肝脏VEGF阳性率、MVD也明显高于正常组及索拉非尼各剂量组，生存时间明显短于索拉非尼中、高剂量组，提示VEGF的高表达同时也是肿瘤转移复发后病变程度重、预后差的标志。因此，VEGF及其相应受体可作为防治肿瘤转移复发的靶点。

　　抗血管生成药物索拉非尼是一种多激酶受体抑制剂，可以通过抑制丝氨酸/苏氨酸受体激酶、受体酪氨酸激酶、VEGF、血小板衍生因子(PDGF)等，抑制肿瘤生长及肿瘤血管生成。已有研究表明，索拉非尼抑制肿瘤血管生成的作用主要是通过其对VEGFR-1和VEGFR-2的抑制作用实现[20]。在肿瘤组织中，由于缺血缺氧，可能导致肿瘤细胞中某些原癌基因，如Ras、bcl-2等被激活，索拉非尼可能通过阻断Raf/Mek/Erk途径抑制VEGF的表达[21]。本实验中，索拉非尼各剂量组大鼠肝脏中VEGF阳性率均低于对照组(P<0.05)，提示索拉非尼可以降低大鼠肝脏VEGF含量;索拉非尼各剂量组大鼠肝脏MVD明显低于对照组(P<0.05)，提示索拉非尼可能通过抑制大鼠肝脏癌灶VEGF合成，降低其MVD。然而，索拉非尼降低VEGF含量进而抑制微血管生成的具体机制尚不完全明确。

　　癌灶在向周围组织侵袭性生长过程中，瘤旁肝细胞由于受肿瘤侵害出现变性、坏死，肝细胞功能受损，从镜下看，对照组大鼠肝脏病变程度更重，癌灶周边肝细胞破坏明显，而索拉非尼各剂量组大鼠由于肝内癌灶血管生成受到抑制，癌灶坏死明显，癌灶周边肝细胞受累相对减轻。本实验中，索拉非尼虽然不能明显降低肿瘤肝内转移复发率，但是索拉非尼在一定程度上减轻了病肝的病变程度，延长了大鼠的生存期限，中、高剂量组尤为明显(P<0.05)。

　　本研究中动物模型模拟晚期肝癌时肿瘤细胞已经突破包膜脱落、侵入血管，门静脉系统内癌栓形成时进行肝移植的模式，与晚期肝癌肝移植复发过程较为接近， 而且两者主要机制相似，因此该模型比较接近真实的肝癌肝移植术后肿瘤转移复发。本实验中，对照组及索拉非尼各剂量组大鼠肺组织内未出现转移癌灶而肝脏内均出现转移复发癌灶，可见，抗血管生成药物索拉非尼对肝移植术后肿瘤复发率的改善并不明显。而对对照组及索拉非尼各剂量组大鼠的Kaplan-Meier生存分析表明，虽然复发率无明显改善，但是索拉非尼中、高剂量组大鼠生存期较对照组明显长，提示索拉非尼可以通过降低肝癌大鼠肝内癌灶VEGF合成、抑制肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞坏死、减轻肝脏细胞的破坏程度，从而延长宿主荷瘤生存时间。

　　本研究发现，索拉非尼通过降低肝癌肝移植术后复发大鼠肝脏VEGF，减少移植肝癌灶血管生成，进而降低癌灶MVD，减少了癌灶血供、抑制肿瘤生长、促进癌灶坏死，并减轻了肿瘤对肝细胞的损害作用，延长了肿瘤转移复发后大鼠的生存时间，对防治大鼠肝癌肝移植术后肿瘤转移复发起到了积极的作用。本研究对临床肝癌肝移植后肿瘤转移复发的治疗有一定参考价值。

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