肝病患者血清肿瘤标记物含量及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体表达在癌变中的临床意义

　　林尤仕　朱明月　谢协驹　李孟森 作者单位：570102 海口，海南医学院附属医院检验科(林尤仕);海南医学院分子生物学重点实验室(朱明月、李孟森)，病理生理学教研室(谢协驹)

　　【摘要】 目的　探讨血浆透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型胶原(ⅢC)、Ⅳ型胶原(ⅣC)、甲胎蛋白(AFP)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体-2(DR5)、诱捕受体-1(DcR1)的表达与肝纤维化及肝癌变的关系。方法　用ELISA方法测定正常对照组(A组)、肝炎组(B组)及肝硬化并发肝癌组(C组)的HA、ⅢC、ⅣC及LN和AFP的含量，用Western Blotting检测肝癌手术的癌组织、癌旁组织AFP、DR5和DcR1的表达。结果　HA、LN、ⅢC、ⅣC和AFP的血清含量由高到低：C组>B组>A组;(1)ⅢC、ⅣC、LN的相关性：A、B、C组ⅢC、ⅣC、LN表达呈正相关，r分别为0.623、0.651、0.714 (P均<0.05)。(2)C组的各个观察指标均高于B组和A组，特别是血清AFP和HA含量，在A组和B组之间尽管也有统计学的意义(P<0.05)，但是C和A、B组比较，这两者的含量显著性升高(P<0.001)。(3)Western Blotting分析显示，癌旁组织的AFP和DcR1表达明显低于癌组织(P均<0.05);而DR5在癌旁组织表达则明显高于癌组织(P均<0.05)。结论　由肝炎到肝硬化、肝癌的过程中HA的累聚以及LN、ⅢC、ⅣC和AFP的表达是一个渐进的基因激活过程;AFP、DR5和DcR1在肝癌组织的表达变化预示癌细胞耐受凋亡诱导。

　　【关键词】 肝肿瘤;　肿瘤标记，生物学;　肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体

　　【Abstract】　Objective　To study the change of hyaluronic acid(HA)，laminin(LN)，collagen Ⅲ (ⅢC)，collagen Ⅳ(ⅣC)，alpha fetoprotein(AFP)，tumor necrosis factor-related apoptosis inducing-ligand (TRAIL) receptor-2 (DR5) and decoy receptor-1(DcR1) in the serum correlated with the development of hepatic fibrosis or primary hepatic carcinoma.Methods　The serous concentration of HA，LN，ⅢC，ⅣC and AFP in normal control (A group)，hepatitis group (B group) and hepatic cirrhosis or primary hepatic carcinoma group(C group) were detected by ELISA;The expression of AFP，DR5 and DcR1 in lateral cancer or hepatoma tissue were analyzed by Western Blotting.Results　The concentration change of HA，LN，ⅢC，ⅣC and AFP were found significantly higher in 52 patients than those of the normal controls or hepatitis group.The levels of AFP and LN in serum is no significant difference in A group between B group，but C group was significant higher than A and B groups (P<0.01);The expression of AFP，DR5 and DcR1 in primary hepatic carcinoma were significantly higher than lateral cancer (P<0.05).Conclusions　The accumulation of HA and transactivation of LN，ⅢC，ⅣC and AFP genes were predictors in the development of the hepatoma;The expressed alteration of AFP，DR5 and DcR1 were a critical mechanism for hepatoma

　　【Key words】　Liver neoplasms;　Tumor markers，biological;　Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptors

　　肝炎是诱发肝癌的重要因素，原发性肝癌多伴有明确肝炎病史，而在肝癌发生过程，伴有肝硬化者占53.9%～85.0%;肝硬化伴有肝癌者占9.9%～16.6%[1]。血浆透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型胶原(ⅢC)、Ⅳ型胶原(ⅣC)和甲胎蛋白(AFP)是临床上用于诊断肝癌的重要标记物，特别是AFP被认为是诊断肝癌的金标准。LN是一个用于观察肝组织纤维化的重要指标，LN血清水平升高提示肝组织纤维化的可能性大，肝纤维化是因为细胞外基质合成和降解失衡[2]，而在肝癌的发生发展过程中，肝纤维化是肝癌发生的细胞基础，与HA、ⅢC、ⅣC也有关;在肝癌的发生过程中，癌细胞逃避免疫监控是导致癌细胞得以在体内生长的原因，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是淋巴细胞分泌的，能特异性诱导癌细胞凋亡的细胞因子，其与细胞膜上的受体-2(DR5)结合，启动凋亡信号，促使癌细胞凋亡[3]。本研究检测正常人、肝炎患者、肝硬化合并肝癌患者血浆中AFP含量及肝纤维化指标HA、 LN、ⅢC、ⅣC的水平，并研究癌旁组织和癌组织的DR5、诱捕受体-1(DcR1)和AFP表达，探讨肝癌细胞演进过程中这些指标的改变，分析这些指标与肝癌发生的关系。

　　对象与方法

　　1. 研究对象：正常对照组(A组)50例，均为健康体检者，男31例，女19例，年龄18～55岁，平均34岁;乙型肝炎组(B组)56例，均为2004～2009年海南医学院附属医院住院患者，符合2000年中华医学会传染病学分会西安会议诊断标准，男33例，女23例，年龄18～72岁，平均38岁;肝硬化并发肝癌组(C组)52例，符合2000年西安会议标准和2001年第八届全国肝癌学术会议制定的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》，男37例，女15例，年龄 27～76岁，平均49岁。

　　2. 样本采集：3组受试者均晨起空腹采静脉血标本，收集肘静脉血8 ml，离心分离血清后分装，于-80 ℃ 保存，测定血清HA、LN、ⅢC、ⅣC和AFP的含量。

　　3. 试剂和方法：HA、LN、ⅢC、ⅣC和AFP测定用ELISA法，试剂盒购于美国ADI公司(American Diagnostica Inc)，牛血清蛋白，购于美国Sigma公司;酶联仪为美国宝特ELX2800型;小鼠抗人AFP、DR5和DcR1均购自美国Santa Cruz公司。

　　4. Western Blotting 检测癌旁和癌组织AFP、DR5和DcR1蛋白的表达：2004年10月至2009年8月在海南医学院附属医院手术的肝癌患者6例，手术后的组织样本经病理诊断为肝硬化合并肝癌。把癌组织和癌旁组织分开，从这些组织中提取蛋白质，各取样品10 μl进行蛋白定量，以浓度最低管为基准调节蛋白浓度后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。每个泳道加入样品60 μg，浓缩胶80 V电压，分离胶120 V电压电泳至分离胶底部，转印到硝酸纤维素(NC)膜上;NC膜在一抗(1∶500稀释的小鼠抗人AFP、DR5和DcR1 抗体，抗体购于Santa Cruz公司)溶液中4 ℃浸泡过夜，然后转到1∶1000 稀释的羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的二抗溶液中室温浸泡2 h;加入碱性磷酸酶的底物反应，用FUJI 公司(Japan)LAS3000型化学发光/荧光(Chmiluminescence /fluorescence)仪拍摄杂交蛋白质条带。并用TanonGIS-2020 型凝胶图像分析系统扫描后进行灰度值分析，重复3次。

　　5. 统计学处理：血清肿瘤标记物分类变量间用χ2 检验。相关分析用非参数相关(Spearman)分析;使用SPSS 11.0 软件包进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　结　　果

　　1. 各组HA、LN、ⅢC、ⅣC和AFP的血清含量：由高到低为C组>B组>A组，见表1。

　　2. 各组HA、LN、ⅢC和ⅣC的相关性：A、B、C组HA、LN、ⅢC和ⅣC呈正相关，r值分别为0.623、0.651、0.714 (P均<0.05)。

　　3. Western Blotting检测AFP、DR5和DcR1蛋白的表达：癌旁组织的AFP和DcR1表达明显低于肝癌组织，而DR5的表达癌旁组织明显高于肝癌组织。见表2和图1。表1　各组研究对象血清HA、LN、ⅢC、ⅣC和AFP值表2　肝病恶性肿瘤患者癌旁组织和癌组织AFP、DR5和DcR1的表达与β-actin表达的灰度扫描比值

　　讨　　论

　　肝炎病毒感染是诱发肝癌的重要原因。在肝癌的发生和发展过程，肝炎病毒感染是很重要的病因，肝炎病毒感染后，病毒基因整合到肝细胞的基因组，通过肝细胞的基因表达系统，表达病毒的组分，这些组分激发机体的免疫反应，导致肝细胞的损伤，损伤的肝细胞有修复能力，在反复的修复过程，表达LN和胶原蛋白，导致肝纤维化。肝纤维化是一个动态过程，若肝细胞损害-修复这一过程不断进行并日益活跃时，会导致肝细胞的异常增生[4]。HA、LN、ⅢC、ⅣC作为细胞外基质中的蛋白多糖、胶原及非胶原结构多糖成分，主要由间质细胞、贮脂细胞及内皮细胞合成。当肝细胞受到慢性损伤时，肝内纤维母细胞HA合成增加，肝内皮细胞清除HA下降，由于HA的积累和LN、ⅢC、ⅣC合成增多，加快肝细胞的纤维化。本研究发现，在慢性乙型肝炎中上述四项血清学指标均显著高于正常对照者，而在肝癌患者的血清检测指标中，HA的含量变化非常显著，提示肝炎病毒的慢性感染或复制对基质细胞成分的持续性沉积可能是非常重要的致病因素，观察表明，从病毒肝炎开始，肝硬化标记物已经明显改变，这些指标是肝炎发展演化到肝癌的警示物质，本研究结果表明，从患者的血清学方面可能进一步揭示了肝炎、肝硬化及肝癌间的演变关系。所以要对有这些观察指标变化的肝炎患者进行严格的随访和监控。

　　AFP是诊断肝癌的金标准，在本研究的血清学检测中显示，AFP在肝炎的患者表达量与正常人也有统计学意义，提示AFP在肝炎患者的细胞内已经开始被激活，当肝纤维化或者肝癌发生时，AFP表达量显著性升高，表明肝细胞内的AFP表达活跃。AFP具有促进肝癌细胞增殖[5]和抗凋亡诱导的生物学功能[6]，很多研究表明，AFP也具有抗淋巴细胞诱导癌细胞的作用[7-8]。TRAIL是肿瘤坏死因子超家族的新成员，其能与受体结合后特异性诱导肿瘤细胞凋亡，目前发现其有5种受体，其中DR5和DcR1是与TRAIL结合的重要受体。DR5广泛高表达于许多肿瘤组织，而不表达或较少表达于正常组织细胞，当它与特异的配体相结合时，仅选择性地杀伤肿瘤细胞或转化细胞，而对机体的正常细胞无明显毒性作用，这是肿瘤坏死因子受体所无法比拟的[9]。而TRAIL与DcR1结合后，由于DcR1缺乏胞内的死亡结构域，无法传递凋亡信息，所以DcR1称为“诱骗受体”，是正常细胞或肿瘤细胞逃避TRAIL诱导凋亡的重要机制[10]。 本研究发现，在人肝癌组织中DR5的表达均低于癌旁组织，而AFP和DcR1的表达则高于癌旁组织，提示AFP、DR5和DcR1表达改变是肝癌进展过程中的重要分子指标。在肝癌发生过程中，TRAIL受体的表达具有癌细胞逃避免疫监控和接受TRAIL诱导凋亡的双重作用，也是肿瘤细胞在复杂的细胞因子作用下基因表达的动态激活过程。这个过程可能涉及复杂的基因调控机制，所以本研究所观察的指标与肝癌的相关性，不仅能预警肿瘤的发生，而且能观察到肝癌发生过程的基因表达动态调节。新近研究显示，AFP是肝癌治疗后生存和预后[11]以及预示肝移植后肝癌复发的重要指标[12]，肝癌细胞表达的AFP能抑制TRAIL死亡受体表达[7]，而且实体肿瘤发生过程中DcR1表达升高[13]和DR5表达降低[14]是肿瘤细胞逃避TRAIL等细胞因子诱导凋亡的自我保护机制，最近研究发现肝癌细胞内合成的AFP也能抑制TRAIL受体介导的caspase信号传递，对抗TRAIL诱导细胞凋亡作用[6]，提示AFP是肝癌细胞生长过程中起关键性作用的细胞因子。本研究用蛋白质杂交分析AFP在肝癌组织的表达，非常直观地显示AFP表达的改变，特别是把AFP表达与TRAIL受体表达联系在一起，能分析AFP与这些受体表达存在一定的关联性。

　　本研究结果提示，肝癌的发生是个复杂的多基因调节过程，由于AFP是诊断肝癌的金标准，也是具有调节癌细胞增殖功能的细胞因子，所以很有必要进一步深入研究AFP对这些观察指标表达的调控作用，为肝癌发生、发展和预后提供科学的理论依据。

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