低频超声、微泡造影剂在肿瘤治疗中的研究进展

　　白文坤　申锷　胡兵 作者单位：200233　上海交通大学附属第六人民医院超声医学科 上海超声医学研究所

　　【关键词】 低频超声 微泡造影剂 肿瘤 研究进展

　　随着超声影像新技术的不断发展和超声造影剂制备技术的不断改进，低频超声、超声造影剂在肿瘤治疗中的作用日趋重要。本文就这一领域的研究进展进行综述。

　　一、低频超声在肿瘤治疗中的进展

　　低频超声是指频率范围在20 kHz至1 MHz的波长较长的波，具有在组织中易穿透，声能吸收少，对组织损伤小的特点。低频超声具有机械作用、空化作用、热作用和化学效应等，利用这些效应，低频超声广泛地应用于临床治疗中，如抑制细菌生长、增强药物的治疗作用，进行体外溶栓等[1-3]。

　　近年来，低频超声的应用研究不断深入，实验研究已揭示低频超声在肿瘤治疗中具有较好潜力。低频超声在组织中衰减低，同样声压下进入组织更深，且低频率、低强度对组织生物的热效应、空化效应也较弱。同时正常细胞对低频超声具有相当的抵抗力，而恶性肿瘤细胞却对其非常敏感，奠定了低频超声用于肿瘤治疗安全性的理论基础[4-5]。

　　1. 单独应用低频超声抑制肿瘤细胞增殖：低频超声可以诱导肿瘤细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞增殖。潘长川等[6]应用钛金属超声探头，探头直径3 mm，频率20 kHz，校正功率0.2 W/cm2，对急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞株进行辐照1 min，然后进行细胞凋亡率和细胞周期分布的分析，结果显示辐照组较对照组肿瘤细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义，而且细胞分布周期显示肿瘤细胞辐照后细胞阻滞于G1→S期，处于DNA复制和分裂活动的细胞数目减少，肿瘤细胞增殖受抑制。张震等[7]应用1 MHz超声探头，辐射大鼠脑胶质瘤细胞株(C6细胞)，超声辐射深度为5 mm，辐照时间20 s，按超声照射强度不同分组，结果显示采用不同强度的低频超声辐照C6细胞，观察到超声强度<50%时随低频超声强度增加C6细胞的生长率下降。应用TUNEL法观察，超声强度<50%时随着超声强度的增加C6细胞凋亡率增加，细胞的形态明显变化，细胞生长率与凋亡率显著负相关。这些研究结果表明，低频超声能显著抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡。另外，研究还发现低频超声辐照肿瘤细胞后可以检测到肿瘤细胞上的193个基因下调和201个基因上调，这些下调基因与细胞生长和增殖、基因表达有关，上调基因与细胞运动、多态性和死亡有关[8]。预示低频超声可以在基因水平改变肿瘤细胞的生物学行为，为低频超声进行肿瘤的生物学治疗提供了较新的实验基础。

　　2. 低频超声的化疗增敏效应：肿瘤的化学治疗是目前临床治疗肿瘤的重要方法，增加化疗药物的敏感性，减少药物治疗用量，减少其毒副作用是化疗药物使用的重要目标。超声波辐照能够造成细胞膜通透性增高，影响细胞膜表面的酶活性从而引起肿瘤细胞内药物浓度增加，增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用，并可诱导肿瘤细胞凋亡[9]。

　　Schroeder等[10]把直径<100 nm的脂质体包裹的化疗药物顺铂注射到淋巴瘤的动物模型的腹腔内，同时给予低频超声(探头直径13 mm，频率20 kHz，校正功率5.9 W/cm2)辐照120 s，结果显示给予低频超声辐照的试验组顺铂的释放量(69.6%)较未辐照组(2.8%)明显增强，且释放强度高出近25倍，明显增强了局部顺铂的药物浓度，并且接受超声辐照的肿瘤细胞内药物浓度为未接受超声辐照的肿瘤细胞内的浓度的2.7倍，进而增强了顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用，使之能够更好地抑制肿瘤DNA复制，杀伤肿瘤细胞。Nelson等[11]分别应用20 kHz、70 kHz的低频超声对静脉注射多柔比星的动物模型给予辐照，结果发现，给予低频超声辐照组的肿瘤大小均明显小于未给予超声辐照单静脉注射多柔比星组的肿瘤大小(P=0.0062)，且应用70 kHz的更加明显。Myhr等[12]同样发现低频超声对肿瘤组织进行辐照后，能够同化疗药物发生协同作用，加强抗肿瘤药物对肿瘤的杀伤作用。

　　二、微泡造影剂

　　1968年，Gramiak行X线主动脉造影时，经左心导管注入振荡的生理盐水后，在超声心动图上偶然观察到主动脉内云雾状回声增强现象，自此开始了微泡超声造影剂的研究时代。微泡超声造影剂基本是一个血池造影剂，并不渗透到血管外组织中，因此超声造影容许超声动态观察脏器的血流情况，包括大血管(构架血管)及微小血管的分布。常规微泡造影剂的微泡直径绝大多数在2～6 μm，与红细胞直径相似，自外周静脉快速注射进入人体后，微泡能够通过肺循环进入体循环，从而使脏器显像增强[13-14]。随着分子成像技术的不断发展，近年来涌现了多种纳米级超声造影剂，包括纳米级脂质体造影剂、纳米级氟碳乳剂，最近又出现了一种纳米级微泡造影剂[15]，既能通过肿瘤的血管壁，又能具有很好的回声特性。

　　含有气体的微泡造影剂在超声波的作用下不断地压缩和膨胀，在低声压时，微泡产生对称性压缩和膨胀，在高声压时，微泡产生非对称性压缩和膨胀，呈非线性背向散射。当声能达到一定强度时，可导致微泡破裂，微泡破裂可以降低超声空化效应阈值，增强空化效应。空化效应所产生的休克波不仅使细胞膜通透性增加，还可使微血管破裂，内皮细胞间隙增宽[16]，同时微泡造影剂在低频低功率超声辐照下介导血管内皮层破坏，可以暴露血管内皮下层，引起血管内血栓形成，这种作用可以限制某些特定部位的血流，阻断恶性肿瘤组织的血供[17]。超声破坏微泡造影剂可以在细胞膜“钻孔”，使DNA的基因转染和表达明显提高[18]，为微泡造影剂携带基因定位治疗提供了理论基础。

　　三、低频超声联合微泡造影剂在肿瘤治疗中的进展

　　低频超声及微泡造影剂在抑制肿瘤细胞方面均有明显作用，两者联合应用，同样具有明显的抑制肿瘤细胞的作用。

　　房良华等[19]研究了低频超声联合微泡对肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用。结果发现超声联合微泡剂能够显著抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并且低频超声联合微泡剂可能是通过增加细胞外ROS的活力来诱导对细胞的损伤和凋亡，对超声联用微泡抑制细胞增殖的机制进行了探讨。董虹美等[20]观察低频超声、微泡造影剂及两者联合应用对米托蒽醌杀伤人乳腺癌细胞MCF27作用的影响，并且透射电镜可观察到乳腺癌细胞凋亡形态学改变，发现低频超声可以通过声致孔效应使细胞膜通透性增加，同时微泡造影剂加强了这种作用，化疗药物通过高通透性的细胞膜进入细胞内部，对肿瘤细胞进行杀伤，诱导其凋亡的产生，通过微观的水平对低频超声、微泡造影剂对增强化疗药物的疗效进行了阐述，为低频超声联用微泡造影剂的化疗增敏效应提供了实验基础。

　　近年来，人们发现超声造影剂还是一种很好的基因载体，作为载体，超声微泡结合超声技术可望实现局部定位释药，达到定位释放，节省药物并且降低毒副作用的目的。聂芳等[21]发现应用微泡造影剂作为基因载体，低频超声辐照加微泡造影剂能够增加绿色荧光标记的质粒对小鼠肝癌细胞的转染，且无组织损伤，为微泡造影剂携带抑癌基因治疗肿瘤提供了实验基础。Crowder等[22]运用全氟化碳脂质纳米造影剂进行体外靶向研究，将荧光标记的靶向纳米造影剂加到体外培养的C32黑素瘤细胞中，并给予低频超声辐照，发现超声辐照组细胞质内的荧光浓度是不用超声辐照的2倍，证明低频超声辐照脂质纳米造影剂能促进荧光标记的磷脂进入细胞，进而推测低频超声可以促进亲脂性药物进入细胞。

　　四、展望

　　肿瘤的治疗成为目前研究的热点，多种技术包括影像学技术已经深入地应用到肿瘤的治疗中。高强度聚焦超声(HIFU)已经在肿瘤治疗中取得了一定的疗效，目前研究表明低频超声在诱导肿瘤细胞凋亡、增加化疗药物治疗效果及增加肿瘤细胞内化疗药物浓度等方面具有明显作用，尤其是和微泡造影剂联合应用及作为基因治疗的载体治疗肿瘤的优越性，相信会越来越多地应用到肿瘤的治疗方面。但其作用机制还未完全明了，作用强度、时间、微泡浓度等参数需要进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]　Conner-Kerr T， Alston G， Stovall A，et al.The Effects of Low-frequency Ultrasound(35 kHz) on Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA) in vitro.Ostomy Wound Manage,2010,56(5)：32-42.20511683

　　[2]　Maruani A， Boucaud A， Perrodeau E， et al. Low-frequency ultrasound sonophoresis to increase the efficiency of topical steroids：a pilot randomized study of humans.Int J Pharm,2010,395(1/2)：84-90.20472045

　　[3]　Tsivgoulis G， Eggers J， Ribo M， et al.Safety and efficacy of ultrasound-enhanced thrombolysis：a comprehensive review and meta-analysis of randomized and nonrandomized studies.Stroke,2010,41(2)：280-287.20044531

　　[4]　Ashush H，Rozenszajn LA，Blass M，et al.Apoptosis induction of human myeloid leukemic cells by ultrasound exposure.Cancer Res,2000,60(4)：1014-1020.10706118

　　[5]　Lejbkowicz F， Salzberg S. Distinct sensitivity of normal and malignant cells to ultrasound in vitro.Environ Health Perspect,1997,105 Suppl 6：1575-1578.9467085

　　[6]　潘长川，陈文卫，石华，等.低频超声对体外培养肿瘤细胞的凋亡诱导和增殖抑制.中国超声医学杂志，2004,20(12)：881-884.

　　[7]　张震，杨松涛，樊立林，等.低频超声体外诱导C6胶质瘤细胞凋亡的研究.中国医科大学学报，2009,38(2)：87-95.

　　[8]　Tabuchi Y，Takasaki I，Zhao QL，et al.Genetic networks responsive to low-intensity pulsed ultrasound in human lymphoma U937 cells.Cancer Lett,2008,270(2)：286-294.18571840

　　[9]　夏新蜀，余和平，白定群，等.细胞凋亡在肿瘤超声治疗中的作用.临床超声医学杂志，2007,9(11)：674-675.

　　[10]　Schroeder A，Honen R，Turjeman K，et al.Ultrasound triggered release of cisplatin from liposomes in murine tumors.J Control Release,2009,137(1)：63-68.19303426

　　[11]　Nelson JL，Roeder BL，Carmen JC，et al.Ultrasonically activated chemotherapeutic drug delivery in a rat model.Cancer Res,2002,62(24)：7280-7283.12499270

　　[12]　Myhr G， Moan J. Synergistic and tumour selective effects of chemotherapy and ultrasound treatment.Cancer Lett,2006,232(2)：206-213.16458117

　　[13]　Mattrey RF，Aguirre DA.Advances in contrast media research.Acad Radiol,2003,10(12)：1450-1460.14697013

　　[14]　Morawski AM，Lanza GA，Wickline SA.Targeted contrast agents for magnetic resonance imaging and ultrasound.Curr Opin Biotechnol,2005,16(1)：89-92.15722020

　　[15]　Oeffinger BE，Wheatley MA.Development and characterization of a nano-scale contrast agent.Ultrasonics,2004,42(1-9)：343-347.15047309

　　[16]　彭晓琼，王志刚.超声与微泡在血管病变治疗方面的应用.声学技术，2004,23(3)：116-118.

　　[17]　Hwang JH， Brayman AA， Reidy MA， et al.Vascular effects induced by combined 1-MHz ultrasound and microbubble contrast agent treatments in vivo.Ultrasound Med Biol,2005,31(4)：553-564.15831334

　　[18]　Lawrie A，Brisken AF，Francis SE，et al.Microbubble-enhanced ultrasound for vascular gene delivery.Gene Ther,2000,7(23)：2023-2027.11175314

　　[19]　房良华，姜藻，顾晓怡.低频超声联合微泡剂对肝癌细胞SMMC-7721的生物学效应.东南大学学报：医学版，2008,27(4)：264-267.

　　[20]　董虹美，王志刚，冉海涛，等.低频超声辐照微泡造影剂增强米托蒽醌对乳腺癌细胞的毒性作用.中国医学影像技术，2010,26(3)：401-404.

　　[21]　聂芳，徐辉雄，吕明德，等.微泡造影剂联合超声辐照介导的绿色荧光蛋白质粒转染小鼠肝癌的实验研究.中国超声医学杂志，2007,23(2)：95-97.

　　[22]　Crowder KC， Hughes MS， Marsh JN，et al.Sonic activation of molecularly-targeted nanoparticles accelerates transmembrane lipid delivery to cancer cells through contact-mediated mechanisms：implications for enhanced local drug delivery.Ultrasound Med Biol,2005,31(12)：1693-1700.16344131