皮动蛋白在结直肠肿瘤组织中的表达及临床意义

　　李挺　徐美荣　黄宏伟　王鼎　朱建伟　 作者单位：226001　江苏南通，南通大学附属医院普外科

　　【摘要】 目的　研究皮动蛋白基因在结直肠组织中的表达，分析其与临床病理因素及肿瘤侵袭性转移和预后的关系。方法　采用免疫组化ELIVISION二步法，检测皮动蛋白基因在27例正常黏膜组织，13例结肠腺瘤组织及80例结直肠癌组织中的表达。结果　皮动蛋白表达在结直肠癌中明显高于结肠腺瘤和正常黏膜组织，正常黏膜中表达率为11.1%，结肠腺瘤中表达率为76.9%，结直肠癌中皮动蛋白阳性表达率为82.5%，组间差异均具有统计学意义(P<0.01);皮动蛋白阳性表达在低中分化癌中均显著高于高分化癌(P<0.01);有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组(P<0.01);TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组中表达显著高于Ⅰ期组(P<0.01);同时皮动蛋白的表达水平与肿瘤浸润深度、5年生存率有显著相关性(P<0.01);与性别、年龄、部位、肿瘤大小、病理类型等无关(P>0.05)。结论　皮动蛋白基因的高表达与肿瘤细胞的侵袭性转移性有关，可以被用作判断结直肠癌预后的一个标志。皮动蛋白的高表达不仅可以判断结肠癌的预后而且对诊断癌前易感病变具有重要参考价值，同时提示可能在大肠腺瘤的形成中起重要作用。

　　【关键词】 皮动蛋白;　结直肠肿瘤;　免疫组织化学;　肿瘤标记，生物学

　　【Abstract】　Objective　To study the expression of Cortactin in colorectal tissues，and investigate the relationship between the expression of Cortactin and clinical pathological factors，neoplasm invasion and metastasis and prognosis.Methods　Immunohistochemical ELIVISION two-step method was used to detect the expression of Cortactin in 80 cases of colorectal carcinoma,13 cases of colorectal adenoma and 27 cases of normal colorectal tissues. Results　The expression of Cortactin in colorectal carcinoma was significantly higher than that in colorectal adenoma and normal colorectal tissues.The positive expression rate of Cortactin was 11.1% in normal colorectal tissue group,76.9% in colorectal adenoma group and 82.5% in colorectal carcinoma group，and the diifference between every group was statistically significant(P<0.01).Within the colorectal carcinoma tissues，the positive expression rate of Cortactin in moderate and poorly differentiated carcinoma was significantly higher than that in well-differentiated carcinoma respectively (P<0.01).The expression of Cortactin was significantly associated with lymph node metastasis (P<0.01).And there was also higher expression of Cortactin in the Ⅲ-Ⅳ stage than that in theⅠstage，and the difference was significant(P<0.01).In addition，the expression of Cortactin was significantly associated with 5-year survival rate and depth of tumor invasion(P<0.01).There was no relationship between Cortactin protein expression and gender，age，location，tumor size and pathological typer(P>0.05).Conclusions　The highexpression of Cortactin protein was associated with neoplasm invasion and metastasis，and Cortactin could be used as an independent prognostic biomarker for the colorectal carcinoma patients.The high Cortactin protein expression could not only estimate the prognosis of colon cancer，but also had the important reference value to diagnose the precancerous susceptibility lesions，and suggested that Cortactin possibly played an important role in colorectal adenoma formation.

　　【Key words】　Cortactin;　Colorectal neoplasms;　Immunohistochemistry;　Tumor markers，biological

　　皮动蛋白(Cortactin)是由位于染色体 11q13 区上的CTTN基因(也称为 ESM1基因)所编码、具有多种不同细胞功能的蛋白质，其最初作为致癌的酪氨酸蛋白激酶v-Src的底物而被鉴定发现[1]。皮动蛋白在细胞骨架重塑过程中发挥重要作用，可影响细胞的运动性、侵袭性、突触发生、吞噬以及肿瘤发生和转移灶形成，同时还是连接细胞骨架重建信号通路的关键部分。本研究采用免疫组化方法，对皮动蛋白基因在结肠正常组织及结肠腺瘤、结肠癌中的表达进行检测，旨在探讨皮动蛋白与结肠癌的临床病理关系，尤其是与肿瘤的侵袭性、转移性以及预后的关系。

　　资料与方法

　　1. 一般资料：2003年1月至2004年12月南通大学附属医院普外科收治的27例正常黏膜、13例结肠腺瘤组织标本、80例原发性结直肠腺癌根治术蜡块标本。所有标本均经病理学确诊，标本活检取材前未行放、化疗，未服用非类固醇类抗炎药。其中结直肠癌患者男48例，女32例，年龄28 ～83 岁，中位年龄59.5岁。80例结直肠癌中TNM Ⅰ期24例、Ⅱ期20例、Ⅲ～Ⅳ期36例。根据肿瘤分类分级标准，高分化腺癌14例，中分化腺癌28例，低分化腺癌38例。

　　2. 试剂与方法：皮动蛋白兔抗人多克隆抗体(美国SANTA CRUZ生物技术有限公司生产)，工作浓度为1∶50。采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪，ELIVISION二步法进行染色。免疫组化所用一抗及ELIVISON试剂盒(PV-9000)和DAB酶底物显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡组织切片常规脱蜡、水化，其余操作按ELIVISON试剂盒说明书进行。用已知皮动蛋白阳性的肝细胞癌组织切片为阳性对照，正常结肠黏膜作为正常对照组，以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　3. 免疫组化结果判断：皮动蛋白阳性定位于胞质，呈棕黄色颗粒状，对阳性表达估计综合阳性细胞百分比及染色强度，采用半定量积分法判断，阳性细胞<5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度呈淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞百分比和染色强度两项积分相乘，0分为阴性(-),1～4分为弱阳性(+),5～8分为阳性(+ +),9～12分为强阳性(+++)。

　　4. 统计学分析：应用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，对计数资料采取χ2检验、Fisher′s精确检验，对等级相关资料采取Spearman检验。绘制Kaplan-Merier生存曲线，生存率的比较采用Log- rank检验。

　　结　　果

　　1. 皮动蛋白的免疫组化观察：皮动蛋白在正常黏膜上皮中有表达，本实验中发现在27例正常结肠黏膜中有3例呈弱阳性表达于胞质，为弥漫性淡黄色颗粒状(图1)。13例结肠腺瘤中有10例呈阳性表达(图2)。在结直肠癌细胞中绝大多数阳性或强阳性表达于胞质及腺腔缘，呈棕黄色颗粒状，定位清晰，组织背景非特异性反应微弱(图3)。本研究中80例结直肠癌患者中有14例为皮动蛋白阴性表达，阳性表达约占全部肿瘤标本的82.5%(66/80)，而在所有阳性表达的癌细胞中有18.2%(12/66)强阳性表达，有45.5%(30/66)的癌细胞阳性表达，有36.4%(24/66)弱阳性表达。

　　2. 皮动蛋白在结直肠正常黏膜组织、腺瘤组织、腺癌中的表达(表1)：皮动蛋白在正常黏膜上皮中多数不表达，本实验中发现在27例正常结肠黏膜中有3例呈弱阳性表达(图1)。13例结肠腺瘤中有10例呈阳性表达(图2)。皮动蛋白在结直肠癌中的阳性表达率为82.5%，与正常黏膜组织和结肠腺瘤组织相比差异有统计学意义(P<0.01)，正常黏膜组织与结肠腺瘤组织比较差异有统计学意义(P<0.01)。表1　皮动蛋白在结直肠肿瘤及正常黏膜中的表达

　　3. 皮动蛋白的表达与结直肠癌临床病理因素的关系(表2)：皮动蛋白表达与性别、年龄、部位、肿瘤大小、病理类型等无关(P>0.05)，而与组织学分级、浸润深度、TNM分期、有无淋巴结转移等有关(P<0.01)。皮动蛋白在低、中分化腺癌中的表达均显著高于高分化癌(P<0.01)，有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(P<0.01)。

　　4. 皮动蛋白表达与结直肠癌患者的生存率(表3、图4)： 在随访成功的42例患者中存活18例，死亡24例。皮动蛋白表达阴性9例，其中死亡3例。皮动蛋白表达阳性(+～+++)33例，其中死亡21例。皮动蛋白表达阴性组的5年生存率明显高于皮动蛋白表达阳性组的5年生存率(66.7% vs. 36.4%;Log-rank：χ2=15.58，P=0.002)。图4是建立在皮动蛋白表达基础上的5年生存率的评估。为了与其他临床病理因素相比较，我们通过Log-rank检验分析了组织学分级、淋巴结转移、TNM分期、浸润深度、肿块大小与生存率的关系(表3)。结果发现细胞分化、淋巴结状况、TNM分期、浸润深度对生存率有显著影响(P值分别为0.0316、0.0001、0.003和0.0026)。皮动蛋白的表达增高与5年生存率的下降有显著相关性。表2　皮动蛋白表达与结直肠癌临床病理因素的关系表3　临床病理因素与5年生存率的关系

　　讨　　论

　　对于皮动蛋白的研究，近年来人们主要将目光投向肿瘤领域，在许多肿瘤中发现ESM1 基因的扩增和皮动蛋白的过表达与肿瘤的侵袭、转移有着密切的联系[1]。我们在van Rossum等[2]的研究中了解到，皮动蛋白由单一基因 EMS1编码，又名CTTN、EMS1等，全长约38 kb，含有18 个外显子。 其mRNA具有 3248个核苷酸，169～1821这一段为编码蛋白质的开放阅读框(ORF)，起始密码子ATG位于第3个外显子上。皮动蛋白主要调节细胞运动能力而影响肿瘤的侵袭力[3]。对乳腺癌MDA2MB2231细胞株的研究也已证实体外皮动蛋白能促进癌细胞的侵袭、转移[4]，皮动蛋白的过表达与乳腺癌的增殖和转移过程密切相关[5]。最新的研究表明，特异定位于细胞皮质的皮动蛋白作为联系细胞外的信号分子和细胞骨架的桥梁，既参与细胞的生长和信号转导，又可接受胞外信号，使骨架蛋白重新分布，调节细胞运动能力，是促进肿瘤侵袭和转移的分子机制之一[6-7]。此外Zhang等[8]在实验中观察到结肠直肠癌中皮动蛋白在侵袭潜能强的癌细胞中呈强免疫染色，并在培养的癌细胞黏附端伸出的板状伪足中富集，这与本研究是一致的。

　　本研究通过检测27例正常结肠组织、13例腺瘤和80例结直肠癌组织中皮动蛋白的表达，发现皮动蛋白表达强度与肿瘤浸润、癌组织病理学分级和淋巴结转移密切相关。随癌分化降低皮动蛋白表达增强，并与临床分期有关，与年龄、性别、肿瘤大小等无关。有淋巴结转移组皮动蛋白的表达明显高于无淋巴结转移组。在口腔癌中，EMS1基因的扩增同样与淋巴结的远处转移、组织分化差和预后较差有相关性[9]。本研究36例有淋巴结转移的结直肠癌中，皮动蛋白的阳性率为91.6%，且强免疫染色者较多，其中强阳性表达占阳性表达总数的27.7%，弱阳性表达占63.8%;44例无淋巴结转移的结肠癌中，皮动蛋白的阳性率为75.0%，且表达多较弱，其中强阳性表达占阳性表达总数的4.5%，弱阳性表达占70.0%，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。提示该基因高表达与结肠癌淋巴结转移与侵袭有关。

　　通过Zaharieva等[10]的研究，我们了解到皮动蛋白高表达者出现肿瘤的转移与侵袭能力增强作用的机制如下：皮动蛋白是一种肌动蛋白结合蛋白，它聚集在细胞周边，与肌动蛋白结合，使肌动蛋白交联形成网络结构，进而影响细胞骨架的功能。作用于肌动蛋白的还有一种重要物质，叫做肌动蛋白相关蛋白复合体(actin-related protein complex 2/3)，简称Arp2/3复合体，由7个亚基组成，包括Arp2、Arp3和5个相关多肽(分别为ARPC 1,2,3,4,5)。Arp2/3也位于细胞周边皮质区，能够促使肌动蛋白成核和延伸，在肌动蛋白纤维聚合和交联分支形成网络的过程中起重要作用。CTTN的表达蛋白皮动蛋白是非受体酪氨酸激酶癌蛋白 Src的作用底物。皮动蛋白接受Src等上游分子信号，发生磷酸化，激活细胞肌动蛋白聚合因子Arp2/3，促使肌动蛋白骨架重构，促进细胞的迁移、内吞等细胞运动。迄今对皮动蛋白磷酸化的调节机制还不清楚。磷酸化是否有利于皮动蛋白与细胞内蛋白结合，并下传分子信号，是一个值得研究的内容。朱建伟等[11]研究发现皮动蛋白分子的氨基端是Arp2/3与actin结合的重要结构域，其参与肌动蛋白聚合的过程，对于磷酸化信号的正常转导是不可或缺的部分。E-钙连接素是与肿瘤侵袭转移关系最密切的一种黏附分子，皮动蛋白参与了E-钙连接素介导的细胞间黏附连接的形成和细胞骨架的重组，并在其中起着不可替代的作用[12]。干扰皮动蛋白的功能或直接使用抗皮动蛋白抗体进行干预都能抑制细胞内吞作用。皮动蛋白是细胞内吞作用中必不可少的成分，具有重要意义[13]。这些机制可能与结肠癌侵袭转移有关，但有待于进一步证实。

　　本研究还发现皮动蛋白在正常黏膜中3例阳性表达，阳性表达率为11.1%，在结肠腺瘤表达阳性率为76.9%，而在结直肠癌中表达率为82.5%，组间相比差异均有统计学意义。这些结果说明，皮动蛋白在结直肠癌的发生、发展过程中起着重要作用。我们认为皮动蛋白在腺瘤及腺癌中均呈高表达状态，它与腺癌的发生有关。检测TSPAN-1蛋白的表达水平不仅可以发现癌前易感病变而且对结肠癌的诊断有重要参考意义。同时认为皮动蛋白可能在大肠腺瘤的形成中起重要作用，而大肠腺瘤被认为是癌前易感病变，但这有待于进一步的研究和阐明。

　　检测皮动蛋白的表达水平不仅可以发现癌前易感病变而且对结肠癌的预后有重要参考意义。Jin等[14]研究表明在人肝癌组织和细胞中有皮动蛋白过表达，并认为皮动蛋白是一个能预示肝癌肝内转移的新标志物。在头颈部及乳腺癌中该蛋白过表达或基因扩增均预示着较差的预后[4]。Timpson等[15]在针对头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的研究中发现176例肿瘤组织中有44%呈现皮动蛋白过度表达，这一结果与肿瘤远处淋巴结转移、组织学分级恶性程度增高、局部复发率增加、无瘤生存期缩短以及5年总生存率下降相关。证明皮动蛋白表达状态仍然是局部复发率、无瘤生存率和总生存率的独立的预后因素。

　　当前，TNM分期成为鉴别结肠癌患者不同预后的主要工具，据报道TNM 分期Ⅰ期患者5年生存率达到95%，Ⅱ期67%，Ⅲ 期和Ⅳ期9.4%[16]。在我们的5年生存率随访研究中，Ⅰ期总生存率达83.3%，Ⅱ期达62.5%，Ⅲ～Ⅳ期达13.6%(表3)，并发现在总生存率与疾病分期间存在显著的相关性。皮动蛋白表达与结肠癌TNM分期有关(P<0.01)。结直肠癌中皮动蛋白高表达组的5年生存率明显低于低表达组。皮动蛋白的表达增高与5年生存率的下降有显著的相关性。这些结果再次证明，皮动蛋白是肿瘤预后的重要指标。

　　总之，皮动蛋白可能作为结直肠癌进展和观测预后的一项指标和可能的治疗靶点，具有临床应用价值。

　　(本文图片见光盘)

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