晚期非小细胞肺癌患者一线化疗前后血浆核小体检测及意义

　　作者：张国明,胡礼仪,周业庭,臧家兰　　作者单位：(江苏省沭阳县人民医院(徐州医学院教学医院)，江苏 宿迁　223600)

　　【摘要】目的：探讨核小体(nucleosomes)在晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)化疗前后检测的临床意义及早期预测对化疗药物的敏感性。方法：用ELISA试剂盒对66例晚期NSCLC患者血浆中核小体含量进行测定并与以30名健康对照组进行分析。结果：在进行一线化疗前，NSCLC患者核小体水平为215(32～316)ng/mL，显著高于对照者30(2～112)ng/mL，一线药物化疗后，有效组较化疗前显著下降(P〈0.05)，且与病情稳定及进展者核小体水平有显著的统计学差异(P〈0.05)。结论：血浆核小体可作为监测NSCLC化疗中生物化学反应性的有效指标，可能对早期化疗疗效的评价具有重要的指导意义，为个人体化治疗提供方案。

　　【关键词】 核小体;肺癌;化疗;预测;监测

　　[ABSTRACT] Objective： To explore the clinical significance of nucleosomes in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients that underwent chemotherapy and its value for sensitivity prediction. Methods： Plasma nucleosomes content in 66 cases with NSCLC by ELISA kit was detected and compared with that of 30 healthy controls. Results： Before the chemotherapy with first-line drugs， nucleosomes level in NSCLC patients was 215 (32～316) ng/mL， significantly higher than 30 (2～112) ng/mL of the control group. After chemotherapy， nucleosomes level significant decreased for those showed curative effects which also showed significant difference from patients under stable status or on progress of cancer (P〈0.05). Conclusions： Plasma nucleosomes can be used for indicators monitoring biochemical reaction during chemotherapy for NSCLC patients， it′s also useful for curative effects evaluation in early stage of chemotherapy.

　　[KEY WORDS] Nucleosomes; Lung cancer; Chemotherapy; Prediction; Monitoring

　　核小体(Nucleosomes)由DNA和组蛋白组成，当细胞死亡时释放到循环血中。健康人外周血中有很少量的核小体，以往关于核小体的研究主要针对系统性红班狼疮[1]，最近研究表明核小体在许多肿瘤表达上调，免疫性疾病和应激情况，如休克、外伤、脓毒血症等时亦表达上调[2]。在细胞更新与死亡越活跃的情况下，外周血内的核小体水平越高，本研究检测了健康人以及NSCLC患者血浆核小体水平变化，并探讨其在NSCLC患者疗效评价的临床意义及早期预测对化疗药物的敏感性。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料

　　2007年10月～2009年12月我院收治的66例初诊的NSCLC患者，年龄45～72岁，平均年龄59岁，原发肿瘤灶可测量病灶(即胸片或普通CT肿瘤病灶最长直径≥2 cm，螺旋CT≥1 cm)。所有患者经病理学或细胞学证实为NSCLC，Ⅲ～Ⅳ期，男性37例，女性29例，肺腺癌31例，肺鳞癌35例，根据1997国际抗癌联盟(UICC)分期，ⅢA期6例，ⅢB28例，Ⅳ期32例。30名健康对照为我院体检中心体检健康者，男、女各15例，年龄29～76岁。

　　1.2　方法

　　标本采集化疗第1周期的前1 d、第8天以及第2周期前和第3周期的化疗前后采血(化疗周期为28 d)，EDTA抗凝5 mL,3 000 r/min 15 min分离血浆，-70 ℃贮存待检。具体方案：(1)血浆核小体检测ELISA试剂盒购自德国宝灵曼公司，操作严格按说明书进行。(2)所有患者均接受一线化疗药物化疗，化疗方案：GP(吉西他滨+顺铂)，GEM 1 000 mg/(m2×d) ，静脉滴注，第1、8、15天;DDP 100 mg/m，静脉滴注，第1天。每4周为1周期。(3)于每周期化疗前按1981年WHO标准以CT评价化疗效果，按照一线化疗的疗效分为无效(进展和无改变)，有效(缓解)两组。疗效分4个等级：完全缓解(CR)：指肿块缩小≥50%;缓解(PR)：指肿块缩小≥25%，但<50%;无变化(NC)或稳定(SD)：指肿块缩小〈25%或增大〈25%;进展(PD)：指肿块增大〉25%，或出现新的病变。以上均于4周后CT复核证实。(4)化疗的第一、第二、第三周期前核小体基线水平(baseline value)定义为BV1、BV2和BV3，第三周期末核小体水平定义为BV30，化疗的第一周期第8天血浆核小体水平定义为Day8。

　　1.3　分组

　　按CT评价化疗疗效分3组：有效组(CR+PR)、无改变组(SD或NC)和进展组(PD)。以CR+PR为疾病有效RR。

　　1.4　统计学处理

　　计量资料以中位数(四分位数)表示，使用Stata/SE统计软件进行分析。组间比较用Kruskal-Wallis秩和检验分析，化疗前后比较用Wilcoxon配对秩和检验，以P〈0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　化疗前后血浆核小体水平变化

　　66例NSCLC患者一线化疗前核小体总体平均水平{215 (32～316)ng/mL}、每一组化疗前血浆核小体水平显著高于健康对照者{30(2～112)ng/mL}(P〈0.05)。单变量分析表明，有效(缓解)组第2周期化疗前的基线值(baselin value 2，BV2)和第3周期化疗前的基线值(BV3)显著低于无效(进展和无改变)组(P〈0.05)。而BV1和BV2的差别(BV1-2)和BV1和BV3的差别(BV1-3)的下降幅度则显著高于无效组。

　　2.2　核小体水平与早期预测化疗敏感性的关系

　　66例NSCLC患者按1981年WHO标准以CT评价化疗效果：有效53%(35/66);无效47%[无变化组占48.4%(15/31)，进展组占51.6%(16/31)。]。化疗第二周期前核小体水平BV2与化疗第一周期前核小体水平BV1比较降低预示着对化疗药物敏感，且多下降50 mg/mL左右;一线化疗结束时，血浆核小水平降至正常水平附近{27.3(5.5～111.5)VS30(2～112)ng/mL}。非小细胞肺癌患者一线化疗不同敏感性的血浆核小体水平

　　2.3　化疗前后核小体水平变化与化疗疗效的关系

　　NSCCL在一线化疗前血浆核小体水平在有效组与无效组差异无统计学意义(P=0.231〉0.05)，但BV2、BV3、BV30和Day8有显著的统计学差异(P〈0.05);化疗后有效组BV30与化疗前相比有逐渐降低的趋势且P〈0.05。

　　3　讨论

　　在非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗中，化疗占有极为重要的地位。对于化疗方案的制定，选择肿瘤敏感性药物显得尤为关键。目前肺癌的化疗方案以国际公认标准方案或经验用药为主，未考虑到个体差异等因素，因此，对化疗药物的选择至关重要。许多常用化疗药物被“一视同仁”地用于NSCLC，所以化疗后缓解率不高[3,4]。

　　多数评判化疗疗效标志物主倾向于基因突变或甲基化[5]。肺癌(lung cancer)化疗疗效的评价多半是在几个周期化疗结束后通过影像学方法(如CT，PET-CT等)计算肿瘤体积或直径的变化。在临床实践过程中，若能较早知道肿瘤对化疗反应就可以根据患者的具体情况及时调整治疗方案，可能的方法就是在化疗期间密集监测与死亡肿瘤细胞或肿瘤侵袭性有关的生化指标。细胞死亡的典型产物是核小体。核小体以数个组蛋白为核心外面包绕DNA构成，连接DNA将核小体串联成链样结构。细胞裂解后，内切酶会优先结合于核小体之间的连接部位而将染色体切割成多个单体核小体和寡聚核小体[2]。化疗过程中，随着肿瘤细胞死亡的增加，血浆中核小体水平即处于高水平。核小体在循环中的半衰期很短，核小体清除半衰期仅为4 min[2]。寡核小体可被血中核酸内切酶降解，由肝代谢或由巨噬细胞或免疫细胞清除。组蛋白可直接被肝细胞摄取，而DNA也可在柘否细胞表面降解。血浆中核小体的半衰期呈浓度依赖性增长，在病理条件下会出现延长[2]。化疗治疗有效和释放核小体的量主要取决于[6]：(1)组织和肿瘤的填充，规则地对肿瘤细胞应用化疗药物，细胞死亡释放到循环血中;(2)敏感度或癌细胞抵抗;(3)一般肿瘤的转移率;(4)核小体的基础值，免疫和核小体消除系统。本研究对象为晚期NSCCL患者，化疗前由于大肿瘤细胞的存在，血浆中核小体水平明显高于健康对照组[215(32～316)ng/mL VS 30(2～112)ng/mL]。对化疗药物敏感的患者(有效组)，经过多个同期的化疗，血浆核小体水平持续下降(BV1〉BV2〉BV3〉BV30)，达健康对照水平[27.3(5.5～111.5) VS 30(2～112)ng/mL]。相反，化疗疗效欠佳的患者血浆核小体水平则不降而增的现象，这可能与化疗药物损伤细胞后慢持续性核小体的释放有关。NSCCL在一线化疗后血浆核小体水平在有效组与无效组BV2、BV3、BV30和Day8有显著的统计学差异[P(0.030、0.003、0.025和0.002)〈0.05]，提示一线化疗药物的敏感性与血浆核小体水平密切相关，与相关文献[7,8]一致;本研究还发现血浆核小体水平与NSCCL进展密切相关，核小体水平较化疗前下降者，表明个体对化疗药物敏感，增高者表明疾病的进展。提示血浆核小体水平能先于CT、MRI等影像学检查结果判断肿瘤对化疗药物的敏感性。

　　综上所述，对化疗药物敏感的NSCLC患者化疗过程中血浆核小体水平呈规律性变化，于化疗期增高，化疗间期下降，在化疗第二周期前足以判断出有效性;以核小体来评价早期化疗的敏感性优于CT，在评价化疗疗效方面与CT有高度相关性，对早期预测化疗药物化疗疗效方面有重要的指导价值。临床医生可在每个个体化疗周期的3～8 d检测血浆核小体水平，判断目前所用化疗方案是否合理，以达到最佳化疗时机。随着核小体快速定量的方法及标准化、自动化的建立， 将在早期预测肿瘤对化疗药物的敏感性方面具有重要的临床应用价值，在肿瘤个体化治疗中中发挥重要作用。

　　【参考文献】

　　1　张璇，李薇，张卫云，等.抗核小体抗体测定在系统性红斑狼疮诊断中的应用价值[J].现代检验医学杂志，2010,25(2)：118-120.

　　2　张国明，胡礼仪.核小体与肺癌放化学治疗疗效评价的研究进展[J].新乡医学院学报，2011,28(2)：253-258.

　　3　周兆飞，曹国春，孙晓峰，等.去甲长春花碱持续静脉输注与常规用法联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌的比较[J].江苏医药，2003,29(1)：74-74.

　　4　蔡炜宇，陈颖波.国产紫杉醇联合顺铂周剂量治疗晚期非小细胞肺癌[J].江苏医药，2003,29(1)：76-76.

　　5　Rosell R，Cecere F，Santarpia M，et al.Predicting the outcome of chemotherapy for lung cancer[J].Curr Opin Pharmacol,2006,6(4)：323-331.

　　6　Stefan Holdenrieder and Petra Stieber. Clinical use of circulating nucleosomes[J]. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences,2009,46(1)：1-24.

　　7　Holdenrieder S，Stieber P，von Pawel J，et al.Circulating nucleosomes predict the response to chemotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res ,2004,10(18)：5981-5987.

　　8　Holdenrieder S，Stieber P，von Pawel J，et al.Early and specific prediction of the therapeutic efficacy in lung cancer by nucleosomal DNA and cytokeratin 19 fragments[J].Ann NY Acad Sci,2006,1075：244-275.