磷酸化AKT、AKT2、PTEN在NSCLC中的表达及意义

　　作者：苗丽君,孙振涛,王静,吴秋歌,吴逸明　　作者单位：郑州大学第一附属医院呼吸内科,麻醉科;郑州大学公共卫生学院

　　【摘要】目的 探讨AKT信号转导通路中有关蛋白磷酸化AKT(pAKT)、AKT2及PTEN在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达、相关性及意义。方法 应用免疫组化的方法，检测80例NSCLC组织及35例非肿瘤性肺组织标本中pAKT、AKT2、PTEN的表达，并与临床病理因素进行相关性分析。结果 pAKT、AKT2在NSCLC中高表达，阳性率分别为78.8%、91.3%，显著高于非肿瘤性肺组织中的0、5.7%(P<0.05)。PTEN在NSCLC中低表达，阳性率47.5%，显著低于非肿瘤性肺组织中的 94.3% (P<0.05)。pAKT的表达与患者年龄、性别、组织学类型及分化程度、TNM分期、淋巴结转移无关(P>0.05)。AKT2的表达与淋巴结转移有关，在淋巴结转移组的阳性表达率100%显著高于非淋巴结转移组表达率80.6%(P<0.05)。PTEN表达与淋巴结转移、组织的分化程度有关(P<0.05)。AKT2与pAKT呈正相关(rs =0.596，P<0.01)。PTEN表达与pAKT(rs =-0.240，P<0.05)、AKT2(rs=-0.326，P<0.01)呈负相关。结论 在NSCLC中存在AKT的活化，PTEN表达的丢失与AKT的活化有关，AKT2是PTEN的调节形式之一。

　　【关键词】 非小细胞肺癌;pAKT;AKT2; PTEN

　　The Expression and Clinical Significance of phosphoAKT, AKT2 and PTEN Proteins in Human Nonsmall Cell Lung Cancer

　　MIAO Lijun, SUN Zhentao, WANG Jing, WU Qiuge,WU Yiming, WU Yongjun

　　Department of Respiratory Medicine, The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China,Department of Anesthesiology;3.College of Public Health, Zhengzhou University

　　Abstract：Objective To investigate the expression, clinical significance and relationship of phosphoAKT (pAKT), AKT2 and PTEN in human nonsmall cell lung cancer (NSCLC) tissue.Methods The expression of pAKT ,AKT2 and PTEN in 80 cases of NSCLC and 35 cases of nocancerous lung disease were assessed by immunohistochemistry, and their correlations with clinicopathologic factors were statistically analyzed.Results The positive rate of pAKT, AKT2 was 78.8%、91.3% in NSCLC and 0%、5.7% (P<0.05) in nocancerous lung disease. But the positive rate of PTEN (47.5%) was significantly lower than that of PTEN (94.3%) in nocancerous lung disease (P<0.05). The expression of pAKT didn’t relate to age, sex, histological subtype and tumor differentiation, lymph node metastasis and TNM stages(P>0.05). The positive rate of AKT2 in the group with lymph node metastasis (100.0%) was significantly higher than that of AKT2 in the group without lymph node metastasis(80.6%)(P<0.05). The expression of PTEN correlated with lymph node metastasis and differentiation of NSCLC (P<0.05). In addition, Positive correlations were observed between the expression of AKT2 and pAKT in NSCLC tissues(P<0.05). The expression of PTEN had negative correlations with the expression of pAKT and AKT2 (P<0.05).Conclusion AKT activation may be present in NSCLC. The loss of expression of PTEN may correlate to activation of AKT. AKT2 may be one of regulated forms of PTEN.

　　Key words：NSCLC; pAKT; AKT2; PTEN

　　0 引言

　　许多人类肿瘤组织中都存在磷酸化AKT(phosphoAKT，pAKT)的高表达。AKT2是AKT的亚型之一，已被确定为癌基因[1]，在多种肿瘤组织中都存在AKT2蛋白的过度表达 [2]。抑癌基因PTEN(Phosphatase and tensin homologne deleted on chromosome 10,PTEN)位于此通路的上游，能够负性地调节该通路的活化[3]。本研究通过免疫组化的方法检测AKT通路中有关蛋白pAKT、AKT2、PTEN在NSCLC中的表达、关系及意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　收集郑州大学第一附属医院及河南省胸科医院2002～2004年胸外科手术切除并经病理确诊的原发性NSCLC标本80例，其中男53例，女27例;年龄18～78岁，平均年龄60岁。所有患者术前均未接受化疗、放疗和其他治疗。非肿瘤性肺组织标本35例(支气管扩张10例，肺结核18例，炎性假瘤7例)作为对照组，男22例，女13例，年龄22～72岁。

　　1.2 试剂

　　兔抗人PhosphoAKT(Ser473)单克隆抗体(产品号：3787)为美国Cell Signaling Technology公司产品，购自北京吉比埃生物技术有限公司。兔抗人AKT2多克隆抗体购自武汉博士德公司。兔抗人PTEN多克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色剂均为美国Zymed公司产品，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 实验方法

　　采用SP染色法检测蛋白的表达，pAKT抗体(高压修复，工作浓度1∶25)、AKT2抗体(微波修复，工作浓度1∶100)和PTEN抗体(微波修复，工作浓度1∶50)。用PBS(AKT2、PTEN)或TBS(pAKT)代替一抗做阴性对照，以已知阳性片作阳性对照。

　　1.4 结果判断

　　细胞被染色为淡黄色至棕褐色者为阳性，每个切片随机观察10个高倍镜视野，每高倍镜视野计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。若阳性细胞百分率<25%为阴性(-)，阳性细胞百分率>25%为阳性(+)。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS11.5统计分析软件，采用χ2检验、Fisher精确概率法和Spearman相关分析，以α=0.05为差异有统计学意义检验水准。

　　2 结果

　　2.1 pAKT、AKT2、PTEN的表达特征

　　pAKT的阳性染色大部分仅定位于癌细胞胞浆;少部分也定位于癌细胞胞核，呈核浆型表达，未见单独胞核着色;为淡黄至棕褐色染色，以弥漫性分布为主，在80例NSCLC中63例呈阳性，阳性率为78.8%。在非肿瘤性肺组织中，pAKT无阳性表达，两组对比差异有统计学意义(P<0.05)。

　　AKT2蛋白的阳性染色呈黄色至棕黄色，主要定位于癌细胞胞浆，呈弥漫性分布。癌细胞间质呈阴性表达。在80例NSCLC中73例呈阳性，阳性率为91.3%。在35例非肿瘤性肺组织中，仅2例炎性假瘤呈阳性，阳性率为5.7%，两组对比差异有统计学意义(P<0.05)。PTEN的阳性染色主要定位于癌细胞胞浆，呈黄色至棕黄色，80例NSCLC中38例呈阳性，阳性率为47.5%;35例非肿瘤性肺组织中33例呈阳性，阳性率为94.3%，两组对比差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 pAKT、AKT2、PTEN表达与NSCLC临床病理特征的关系

　　在NSCLC组织中，pAKT表达与患者年龄、性别、组织学类型及组织的分化程度、淋巴结转移、TNM分期均无关(P>0.05)。AKT2的表达仅与淋巴结转移有关，在淋巴结转移组的表达(100%)显著高于无淋巴结转移组(80.6%)(P<0.05)。PTEN在高分化组中的表达显著高于中、低分化组的表达(P<0.05)，在无淋巴结转移组的表达显著高于淋巴结转移组的表达(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、组织学类型及TNM分期无关(P>0.05)。

　　a P=0.003，d P=0.002，为有淋巴结转移组与无淋巴结转移组的比较;b P=0.004，为高分化与中分化的比较;c P=0.000，为高分化与低分化的比较

　　2.3 PTEN与pAKT、AKT2的关系

　　在NSCLC中，PTEN阳性表达与pAKT(rs =-0.240，P<0.05)、AKT2(rs=-0.326，P<0.01)呈负相关。AKT2与pAKT两者共阳性表达63例，在AKT2阴性表达中无pAKT阳性表达，经Spearman相关分析两者呈正相关关系(rs=0.596，P<0.01)。

　　3 讨论

　　研究发现,AKT蛋白的过表达并不能使NIH3T3细胞发生转化，而pAKT蛋白的过表达却能使NIH3T3细胞发生转化[4]。pAKT可以通过磷酸化其下游的20多种作用底物促进细胞的生长、增殖、血管生成、侵袭、转移;抑制细胞凋亡[5]。本研究发现pAKT在NSCLC中高表达，在非肿瘤性肺组织中不表达，提示在NSCLC中存在AKT的频繁活化，AKT活化可能与NSCLC的发生有关。本研究还发现pAKT在不同年龄、性别、TNM分期、组织分化组以及淋巴结转移与无淋巴结转移组均高表达，组间对比差异无统计学意义，与国外有关pAKT在肺癌方面研究基本一致[6，7]，提示pAKT表达在NSCLC中具有普遍性，pAKT参与了肺癌的发生和发展。

　　AKT家族有3个成员(AKT1、AKT2、AKT3)，其中AKT1基因扩增仅发现在胃癌细胞株中，AKT3的基因扩增现象尚未发现，但在很多的人类肿瘤组织中存在AKT2基因扩增和mRNA过表达，AKT2的过表达可以使NIH3T3细胞发生恶性转化[1]，故AKT2与人类肿瘤的发生发展更为密切，AKT2主要介导体内PI3K依赖的细胞的粘附、运动、侵袭和转移效应[8]。本实验发现: AKT2在NSCLC阳性率达91.3%，显著高于非肿瘤性肺组织中的表达，AKT2的表达还与淋巴结的转移有关，提示AKT2的高表达可能参与了肺癌癌变的发生，在促进淋巴结转移方面有重要作用。AKT2被证实是参与结直肠癌[9]、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等肿瘤发生发展的主要形式，本实验证实在NSCLC中AKT2表达与pAKT存在正相关关系，提示AKT2与AKT活化关系密切。

　　PTEN编码一种磷脂磷酸酶，可降解PI3K的催化产物PIP3，抑制AKT的活化，抑制AKT通路的激活[4]。本实验表明在NSCLC中存在PTEN表达的减少或丢失;PTEN的表达与pAKT、AKT2呈负相关，提示PTEN蛋白表达的减少或丢失可能对AKT的活化起正向调控作用，AKT2可能是PTEN的调节形式之一。研究表明在PTEN突变的子宫内膜癌细胞中可见到AKT1、AKT2mRNA水平的增高，而AKT3mRNA水平几乎探测不到[10]，提示PTEN对AKT1、AKT2具有调节作用。本实验与此结果相符，说明在NSCLC中可能存在PTEN对AKT通路的调节，对AKT通路的深入研究有可能为肺癌的治疗提供新的靶位点。

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