光照对姜黄素诱导人乳腺癌MCF-7细胞 凋亡的影响

　　作者：施文荣,张振林,刘艳　　作者单位：1.福建中医学院中西医结合系，福建福州 350108;2.广东医学院检验学院，广东湛江 524023

　　【摘要】目的 研究光照对姜黄素诱导人乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响，探讨其作为肿瘤光动力学治疗新型光敏剂的可能性。方法 体外培养的MCF7细胞加姜黄素后进行光照及避光处理24h，MTT法测细胞生长抑制率，Giemsa、Hoechst33258染色观察形态变化，流式细胞术检测凋亡率和细胞周期分布。结果 单纯光照对MCF7细胞无生长抑制及诱导凋亡作用，光照及避光条件下姜黄素对MCF7细胞生长抑制的IC50分别为2.68、13.44 μmol/L;细胞在光照条件下经5μmol/L姜黄素处理24h即呈现典型的凋亡形态;光照条件下1、2.5、3、5、10 μmol/L姜黄素及避光条件下5、10、15、20、30μmol/L姜黄素处理细胞24h,凋亡率分别为4.06%、16.79%、19.46%、35.97%、59.27及5.71%、8.88%、12.51%、38.04%、26.60%;姜黄素在光照及避光条件下均可引起细胞周期分布发生改变。结论 光照对姜黄素抑制MCF7细胞生长及诱导凋亡具有增敏作用。

　　【关键词】 姜黄素 光照条件 MCF 7 凋亡

　　Effect of illumination on curcumineinduced apoptosis in human breast cancer (MCF7) cells

　　SHI Wenrong,ZHANG Zhenlin,LIU Yan

　　(1. Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Fujian College of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350108, China)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of illumination on apoptosis of human breast cancer (MCF7) cells evoked by curcumine.Methods MCF7 cells were incubated with or without illumination for 24 hours after addition of curcumine. Cell growth, morphology and apoptosis were determined by MTT, Giemsa and Hoechst33258 staining, and flow cytometry, respectively.Results There was no effect of single illumination on the growth and apoptosis of MCF7 cells. The IC50 values of curcumine on MCF7 cells were 2.68 and 13.44 μmol/L with or without illumination, respectively. The typical apoptosis was observed after 24 h exposure to curcumine (5 μmol/L) and illumination. Apoptosis rates of MCF7 cells treated by curcumine at doses of 1, 2.5, 3, 5 and 10 μmol/L and illumination were 4.06%，16.79%，19.46%，35.97%，59.27%, but those treated only by curcumine at doses of 5, 10, 15, 20 and 30 μmol/L were 5.71%, 8.88%, 12.51%, 38.04% and 26.60%, respectively. Pretreatment with curcumine induced the change of cell cycles regardless of illumination.Conclusion Illumination can reinforce the inhibition and apoptosis of MCF7 cells caused by curcumine.

　　Key words: curcumine; illumination; MCF7; apoptosis

　　姜黄素是中药姜黄的主要成分，属于天然酚类抗氧化剂。姜黄素的细胞毒作用及诱导细胞凋亡作用已被多篇文献报道所支持[13]，我们前期研究工作中发现，光照对姜黄素诱导人胃癌MGC803细胞凋亡有增敏作用[4]。为探讨姜黄素作为乳腺癌光动力治疗辅助光敏剂的开发前景，本文以人乳腺癌MCF7细胞为对象，着重研究光照对姜黄素诱导人乳腺癌细胞凋亡的增敏作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株

　　人乳腺癌细胞株MCF7由厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室提供。

　　1.2 药物处理

　　姜黄素(Sigma公司产品)0.1842g先用100μL二甲基亚砜(DMSO)溶解后，用无水乙醇定容至50mL，即为10mmol/L姜黄素母液，分装0.5 mL/管，-20℃避光冻存。应用时以细胞培养液稀释至所需浓度。

　　1.3 光照与避光培养体系建立及分组

　　CO2气体培养箱内固定15W日光灯管，光距20cm，经测量光照强度为210 Lux，避光组细胞培养板(瓶)用通风遮光罩遮挡光线。光照及避光培养体系均维持温度37℃，5%(体积分数)CO2及饱和湿度。细胞分别于光照及避光培养体系下培养，分为避光组及照光组，避光组姜黄素终浓度分别为0(避光对照组)、5、10、15、20、30 μmol/L，照光组姜黄素终浓度分别为0(照光对照组)、1、2.5、3、5、10 μmol/L。

　　1.4 细胞培养

　　MCF7细胞培养于含15%(体积分数)小牛血清、100μ/mL青霉素、100mg/L链霉素及50mg/L卡那霉素的RPMI1640全培液中，37℃、5% (体积分数) CO2及饱和湿度环境下培养、传代。接种时以0.25%的胰酶消化液消化，加细胞培养液吹打成单细胞悬液。细胞按2×105个/mL接种，培养过夜后按实验所需浓度加入药物，照光对照组及避光对照组仅加等量药物溶剂，并按实验分组于光照或避光培养体系下培养。

　　1.5 细胞生长抑制率测定

　　以台盼蓝拒染计数法比较单纯光照培养和避光培养对MCF7细胞生长的影响;以MTT法测定在光照及避光条件下不同浓度姜黄素对MCF7细胞的生长抑制率。细胞分别培养于96孔细胞培养板，各浓度组设计10个复孔。组处理24h后, 于酶标读书仪上测定570nm OD值，各复孔取均值按(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100%计算24h细胞生长抑制率[5]。

　　1.6 细胞形态学观察

　　各组细胞按实验要求于玻片培养24h，常规Gimesa染色，置于显微镜下观察细胞形态。用Hoechst33258染色液染色，置于荧光显微镜下观察细胞核形态。

　　1.7 流式细胞仪分析

　　分组同1.3,每组3个平行,各组细胞接种于细胞培养瓶中，药物处理24h后，用流式细胞仪(EpicsXL Beckman公司)测定各组细胞凋亡比例以及细胞周期分布。按文献[6]方法，每样品取(1～2)×106个细胞。结果分析软件为WinMDI Version 2.8。

　　1.8 统计学处理

　　采用SPSS 13.0 for windows 统计学软件包进行统计，组间数据采用t检验，细胞生长抑制率IC50采用Probit回归。

　　2 实验结果

　　2.1 光照与避光条件下姜黄素对MCF7细胞生长抑制率

　　单纯光照条件下和避光条件下培养MCF7细胞，每组10个样品，于24h后用台盼蓝拒染计数法进行细胞计数，分别为(26.6±2.753)万个/mL和(27.1±2.726)万个/mL,经成组t检验比较，单纯光照组和非光照组在24h的细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)。由此表明单纯光照培养对细胞的生长无明显影响。

　　经药物处理后，姜黄素在光照和避光条件下对MCF7细胞生长均具有抑制作用，并呈浓度依赖关系，见图1。经Probit回归分析，照光组及避光组姜黄素对MCF7细胞的IC50分别为2.68、13.44μmol/L，相同药物浓度在光照条件下的抑制率要显著高于避光条件下的抑制率(P<0.01)。

　　2.2 光照与避光条件下姜黄素对MCF7细胞形态的影响

　　未经姜黄素处理的避光对照组和单纯光照组细胞间基本没有明显的形态变化。在5μmol/L姜黄素作用24h处理后，Giemsa染色观察可见避光组细胞形态较避光对照组无明显变化;照光组绝大部分细胞脱落呈圆形，部分细胞体积变小，折光率下降，细胞数量较对照组显著减少;20μmol/L姜黄素作用24h处理后避光组在可见多数细胞脱落呈圆形，但仍有少量贴壁细胞存在;照光组基本无贴壁细胞存在，培养液中也仅可见少量脱落细胞，且细胞体积显著缩小，折光率下降。

　　经24h处理后，照光组姜黄素浓度为5μmol/L及以上时与避光组在姜黄素浓度为20μmol/L及以上时，均出现典型的凋亡形态，细胞呈圆形，细胞膜完整，一些细胞表面有发泡现象，有染色致密的凋亡小体，染色质凝聚，或附于核膜，或形成边缘清晰的致密凝聚块。

　　Hoechst33258染色显示：避光对照组和照光对照组MCF7细胞核呈弥散均匀的绿色荧光。避光组及照光组姜黄素浓度为5μmol/L时，经24h处理，避光组细胞核形态未见明显改变，而照光组则可见明显的细胞核形态变化，表现为染色质边缘化、染色质凝聚、细胞核固缩，形成凋亡小体等典型的细胞凋亡形态。此外也可见到核边缘模糊，核区形状不规则，荧光微弱且不均匀的坏死细胞。避光组姜黄素浓度为20μmol/L时，细胞核也具有典型的凋亡形态，而照光组姜黄素浓度为20μmol/L时，基本无贴壁细胞存在。

　　2.3 光照与避光条件下姜黄素对MCF7细胞凋亡率及细胞周期分布的影响

　　光照条件下0、1、2.5、3、5、10 μmol/L及避光条件下0、5、10、15、20、30 μmol/L姜黄素处理MCF7细胞24h，用流式细胞术测定细胞凋亡率及细胞周期分布。两组中不同浓度姜黄素的细胞凋亡率均与本组中姜黄素终浓度分别为0的比较,差异均有统计学意义(P<0.01);姜黄素联合光照处理时，在5μmol/L即可使人乳腺癌MCF7细胞具有较高的凋亡率，远高于避光条件下同一姜黄素浓度的高(P<0.01)，与避光条件下20μmol/L姜黄素的凋亡诱导作用相当(P>0.05)，不同浓度姜黄素在光照及避光条件下诱导MCF7细胞凋亡的凋亡率

　　姜黄素在避光条件下作用24h可使MCF7细胞周期分布发生改变，当药物浓度达到10μmol/L及以上时，与避光对照组比较可见G0/G1期细胞比例降低，同时G2/M期细胞比例升高，且10、15μmol/L药物浓度下G2/M期细胞比例又较20、30μmol/L浓度组为高(P<0.01);药物浓度为20、30μmol/L 时与避光对照组比较S期细胞比例升高。照光组不同浓度姜黄素处理与照光对照组比较，均可见G0/G1期细胞比例降低;除10μmol/L药物浓度时G2/M期比例与照光对照组比较无统计学差异外，其余各浓度与照光对照组比较均可见G2/M期细胞比例升高, 且1、2.5μmol/L以及3μmol/L药物浓度下G2/M期细胞比例又较5、10μmol/L浓度组为高(P<0.01); 2.5μmol/L及以上浓度与照光对照组比较，可见S期细胞比例的升高。姜黄素在光照及避光条件下对MCF7细胞

　　周期分布的影响

　　3 讨论

　　在研究过程中，我们发现姜黄素在光照条件下可显著抑制人乳腺癌MCF7细胞的生长，进一步研究表明这种生长抑制作用与细胞凋亡有关。姜黄素已被证实对多种类型细胞具有诱导凋亡作用。据报道，姜黄素在非光照条件下诱导各种肿瘤细胞凋亡的浓度基本相近，约在20～30μmol/L左右[7]。韦达等[8]发现15 μmol/L姜黄素在非光照条件下处理MCF7细胞24h时凋亡率为12.58%。吴晓健等[9]则发现20μmol/L在非光照条件下处理MCF7细胞24h时凋亡率仅为9.30%。本研究的结果显示，姜黄素联合光照处理时，在5μmol/L即可使人乳腺癌MCF7细胞具有较高的凋亡率，与避光条件下20μmol/L姜黄素的凋亡诱导作用相当(P>0.05)，显示光照对此具有增敏作用。

　　姜黄素在非光照条件下诱导细胞凋亡的机制尚不清楚，有学者认为与姜黄素触发细胞内活性氧自由基代谢有关[10]。Dahl等[11]报道了姜黄素对哺乳动物细胞具有光毒效应，提出这种光毒性与氧自由基的产生有关。光照条件下姜黄素对MCF7细胞凋亡的增敏作用是否与活性氧自由基的产生有关还有待验证。

　　姜黄素对MCF7细胞细胞周期分布的影响已有数篇国内外文献报道，但结果差异较大。Simon等[12]报道以姜黄素及姜黄素的同类物(去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素)处理MCF7细胞，均使其细胞周期停滞于G2/M期。Holy等[13]报道姜黄素处理人MCF7细胞24～48h，细胞出现M期停滞，48h之后离开M期，细胞形成多个微核而不是正常的子核，认为姜黄素引起G2/M期停滞和这种细胞核的异常装配有关。韦达等[8]报道，姜黄素处理MCF7细胞24、48、72h的作用主要表现在G1/S期阻滞。吴晓健等[9]则报道,姜黄素处理MCF7细胞24h,细胞周期阻滞于G0/G1期。而我们的研究结果则显示，姜黄素在避光及照光条件下对MCF7细胞的作用均表现为促进细胞周期由G0/G1期进入S期及G2/M期，而S期与G2/M期细胞比例升高的程度，在不同药物浓度下表现不同。由于本研究取样时间为24h,而细胞周期的阻滞与细胞凋亡的发生是一个动态发展过程，姜黄素在光照及避光条件下诱导细胞凋亡是自G1/S检查点或是G2/M检查点启动尚缺乏证据，但值得注意的是，在避光组药物浓度为10、15μmol/L时，G2/M期细胞比例达40%左右，显著高于避光对照组,而此时细胞凋亡率为10%左右;当药物浓度为20、30μmol/L时，G2/M期细胞比例相对10、15μmol/L浓度组显著降低，但凋亡率显著升高。这一现象在照光组也有类似表现。G2/M期细胞比例较高，而凋亡率相对较低的药物浓度组，若进一步延长培养时间，是否会出现类似Holy等[13]所报道的细胞离开M期，出现凋亡的形态学改变，尚需对不同药物浓度及时间点取样进行分析。

　　综上所述，光照可以提高姜黄素对MCF7细胞的抑制作用，并且可增敏姜黄素诱导MCF7细胞凋亡。作为待开发的新型低毒、高效的光敏剂，姜黄素的凋亡增敏作用与光谱特征和光照时间等其它因素的相关性还有待进一步研究。

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