光动力学疗法对肿瘤细胞信号传导通路作 用的研究进展

　　作者：蒋凯,综述,权毅,潘显明,审校　　作者单位：成都军区总医院骨科，四川 成都

　　【摘要】本文通过综述光动力作用对肿瘤细胞信号传导通路影响的研究成果，进一步分析光动力作用抗肿瘤治疗的可能作用机理，对光动力作用的多种可能作用机制深入进行探讨。

　　【关键词】 光动力疗法;肿瘤;信号传导

　　光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)，又被称为光辐照疗法(photoradiation therapy)或光化学疗法(photochemotherapy)。该方法是利用光敏剂分子接受特定波长的光能后通过光化学反应和能量传递过程将光能转化为分子内能，在有氧条件下，产生多种活性氧物质(ractive oxygen species，ROS)，包括单线态氧(1O2)、氧自由基、羟自由基、过氧化氢等，从而对蛋白质、核酸和脂类大分子产生破坏作用，使细胞的结构和功能受到严重影响，导致细胞凋亡或死亡，而起到治疗作用。该作用有两种类型：一种是光敏剂通过电子或质子(e或H+)的转移引起自由基的氧化还原反应，称为Ⅰ型光动力反应;另一种是光敏剂将能量传递给周围的氧分子使其成为单线态氧，称为Ⅱ型光动力反应。PDT因其能相对特异地选择性杀伤肿瘤细胞，对健康组织损伤小，很少发生并发症以及毒副反应小等优点，使其成为一项非常有前途的肿瘤治疗方法。PDT作用的效果与所用光敏剂类型、照射条件、组织氧代谢状态、细胞类型有关，其中光敏剂在细胞内的结合位点因为决定了PDT的最初损伤部位而最为重要[1]。

　　细胞信号传导几乎涵盖了所有的生命现象，是生物体具有的一种十分重要的生理功能。细胞信号传导的异常变化在细胞癌变过程中起着十分重要的作用，信号传导系统的缺陷和异常活化与肿瘤发生、发展及预后的关系已成为肿瘤分子生物学研究热点，同时通过调控信号传导途径治疗肿瘤也成为人们日益关注的焦点[2]。多年前人们研究就发现，PDT不仅能导致细胞凋亡或死亡，还能激发细胞产生逃避反应。细胞在亚致死剂量的物理或化学因素作用下产生的逃避反应会导致相关基因和应激蛋白的表达变化，并从而逃避打击[3]。PDT等外界刺激因素作用后会导致细胞多种信号传导系统产生变化，例如磷酸化与去磷酸化，钙离子或cAMP等第二信使活性的改变，蛋白酶的激活等。同时，PDT还可以改变粘附因子、细胞因子[4]的表达。尽管已经有不少相关研究，但PDT对细胞信号传导系统产生影响的作用机制尚不清楚。同时许多都是体外实验，在体实验有待进一步研究，多种实验模型和光敏剂的使用使问题显得更为复杂。本文拟就PDT对肿瘤细胞信号传导影响的研究进展作一综述，主要讨论PDT对细胞诱导死亡或产生逃避反应的影响，这其中，光敏剂在细胞中的位置、细胞的类型、光动力作用的剂量都有重要的作用。

　　1 线粒体

　　许多脂溶性光敏剂结合并作用于线粒体膜，如酞菁Pc4、苯并卟啉衍生物单酸环A(BPDMA)等，它们在多种疾病中的应用得到广泛研究。多种光敏剂被发现与线粒体膜上的苯二氮卓受体有高亲和力。Kessel D等报道，光敏剂定位于线粒体膜比定位于溶酶体膜或其它浆膜更快的导致细胞凋亡[5]。其机制已部分被人们了解。当光敏剂结合于线粒体膜，PDT会激活特定的信号传导通路，首先是细胞色素c从线粒体进入胞浆。Date M等[6]报道，PADS31介导PDT对人肝癌细胞作用后，可以立刻观察到细胞色素c进入胞浆。同样的结果也在SiPc介导PDT对人黑色素瘤细胞作用或5ALA介导PDT对HL60白血病细胞作用后观察到。这些光敏剂都定位在线粒体膜。研究还发现，PDT能导致线粒体膜电位的降低，这可能与线粒体渗透转运大通道的开放有关。线粒体渗透转运大通道的开放导致线粒体膜去极化，引起Ca2+的释放以及细胞色素c的丢失[7]。但目前这种通道尚未能完全为人们了解，细胞色素c的释放机制以及它与线粒体膜电位的关系也尚需进一步研究。

　　PDT作用以后细胞色素c进入胞浆会导致多种后果。Varnes等观察到加入外源性细胞色素c能够逆转Pc4介导PDT作用对细胞呼吸的抑制作用。表明PDT主要作用于线粒体膜而对呼吸链的主要组成没有损伤，能通过ATP减少导致细胞坏死，也能通过激活半胱天冬酶(caspase)途径导致细胞凋亡。释放出的细胞色素c能形成dATP、凋亡激活因子1(APAF1)以及前半胱天冬酶9的复合体，它能促使前半胱天冬酶9的激活并最终导致前半胱天冬酶3的激活[8]。半胱天冬酶3是细胞凋亡过程的关键酶，和大量其它蛋白的释放有关，如DNA断裂因子。因为人黑色素瘤细胞在SiPc介导PDT作用后的主要死亡模式是凋亡，Barge J推断，细胞色素c的流失是这个过程的关键启动因子。这与Granville的研究结果是一致的，细胞色素c的释放导致caspase3，caspase6，caspase7等多种半胱天冬酶的激活。此外，Barge J还发现了caspase8的延迟激活，而caspase8与CD95/FAS介导的独立的凋亡途径有关。Takahashi H也报道[9]，ATXS10介导PDT对NHK细胞作用后，可以观察到细胞色素c的释放以及随之caspases9/3/6和caspases8/3/6两个半胱天冬酶级联的激活。

　　在凋亡过程中，caspases3激活导致许多与维持细胞正常结构和功能的蛋白因子结构被破坏。如QLT0074 介导PDT作用导致人角质化细胞多聚腺苷酸聚合酶(PARP)的断裂。PARP是一种将多聚二磷酸腺苷转运给组氨酸和其它核蛋白，有助DNA修复的酶，它的结构被破坏将导致功能丧失并最终导致细胞的死亡。尽管半胱天冬酶调节的凋亡过程是PDT导致细胞死亡的主要模式，但并不是不可替代的。Xue LY等[10]研究发现，在Pc4介导PDT对转染有caspase3基因的MCF7c3细胞和无caspase3表达的MCF7细胞的作用中，都观察到了细胞色素c从线粒体中释放，但只在MCF7c3细胞中看到caspase3和PARP的表达。同时MCF7c3细胞在PDT作用后6小时就可以观察到DNA碎片的出现，而MCF7细胞则在PDT作用后20小时才看到DNA的大碎片，其凋亡的程度也远小于MCF7c3细胞。MCF7c3细胞较MCF7细胞对光敏作用更敏感，但是两种细胞在克隆试验中却对光动力杀伤有相同的敏感性。研究表明，Pc4介导PDT作用中，从最初的线粒体损伤到细胞死亡是一个很快的过程，caspase3介导的凋亡过程与这种致死的实验模式可能不相关。

　　Bcl2蛋白位于线粒体膜、内质网膜和核膜上，是抗凋亡蛋白的一种，对调节许多细胞抗凋亡诱导的敏感性有重要的作用。许多人对通过结合于线粒体膜的光敏剂介导的PDT作用中Bcl2及相类似蛋白的调节作用进行了研究。Vantieghem A等[11]研究发现，在血卟啉介导PDT作用过程中，Bcl2的表达能显著抑制细胞色素c的释放，caspase3的激活以及PARP的破坏，减少细胞凋亡，但不能减少PDT导致的细胞坏死。在PDT介导的凋亡过程中，表达Bcl2的细胞存在有caspase依赖的细胞色素c释放相关的反馈调节机制。BclxL蛋白与Bcl2蛋白类似，位于线粒体膜，能够调节细胞色素c的释放从而对PDT诱导的凋亡有调节作用。

　　目前，尽管人们对线粒体进行了更多研究，但有关光敏剂与线粒体膜相结合后导致细胞色素c释放的机制仍未能完全阐清。可能的机制是细胞色素c的释放导致caspase9和caspase3的相应级联反应并最终导致凋亡发生，而Bcl2蛋白家族通过影响细胞色素c的释放调节这一过程。 凋亡与细胞彻底死亡之间也尚有许多不清楚的地方，这可能与我们过于依赖一些简单的短期实验有关，染料排斥、线粒体活力下降等细胞部份功能的丧失可能在短期实验中给了我们细胞活力丧失的结论。Xue LY的研究提示我们在检测细胞死亡的实验中采用细胞克隆试验对检测细胞活力更为可靠，这需要我们改进实验方法进一步研究。

　　2 质膜

　　脂溶性的光敏剂最主要的结合位置就是质膜，这也使质膜成为PDT作用的重要目标。同时许多信号传导通路也是由质膜开始的，因而质膜是PDT干预细胞信号传导系统的重要作用部位。

　　很早就有研究发现，PDT作用以后能迅速激活磷脂酶C(PLC)和磷脂酶A2(PLA2)。这两种膜结合蛋白酶的激活和细胞的许多信号传导过程有关。近期研究发现，PDT能通过PLC激活以及随后的三磷酸肌醇(IP3)合成导致细胞内Ca2+浓度升高[12]。Ca2+浓度升高也可导致PLA2的激活，而PLA2的激活被证明与PDT作用后的凋亡发生相关。

　　Hsieh YJ等[13]报道，血卟啉在A341细胞主要结合于质膜及高尔基体膜，PDT作用后能促使多种信号通路激活，包括活性氧物质的迅速形成，CJun氨基末端激酶的激活，caspase3的延迟激活及PRAP的断裂，线粒体膜电位的丧失等。其中，作者认为活性氧物质的形成最为重要。对于PDT作用于质膜，人们也有不同的报道，Kessel D[14]报道，在PDT治疗中，当PDT作用直接作用于亚细胞结构时会广泛产生细胞凋亡，当细胞质膜为PDT作用的主要目标时，会因为caspase3选择性的被光敏作用损伤导致凋亡的延迟。

　　3 蛋白激酶

　　磷酸化是蛋白翻译后调节的重要方式，蛋白激酶的磷酸化与去磷酸化在信号传导通路的调节中广泛存在。目前有关光动力作用以后信号传导通路中关键信号蛋白激酶磷酸化只有少数几个通路得到了研究。

　　目前研究较多的信号放大途径是通过生长因子介导的有丝分裂原途径。配体与生长因子受体的结合导致细胞内丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中细胞外信号调节激酶(ERK)的激活，产生有丝分裂或不同的结果。EGFR与细胞生长和细胞周期的调节有关，属于受体酪氨酸激酶家族，在配体激活后能自动磷酸化。Ahmad N等[15]报道，在Pc4介导PDT对人皮肤癌细胞(A341)的体内治疗实验中，观察到表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达受到抑制的同时，却可以观察到EGFR的酪氨酸磷酸化。作者从而推测，EGFR抑制剂能够提高光动力作用的疗效。在Pc4介导光动力对A431细胞作用中，当细胞存活率小于1%时，表皮生长因子刺激磷酸化的作用被完全阻断。但是，大剂量PDT作用时，由于其它许多非特异因素的作用，上述研究发现对凋亡产生的作用尚不完全清楚。

　　在有丝分裂原途径中有关ERK的研究有不同的报道。Assefa发现PDT能不可逆的抑制EGF诱导的ERK2激活。而Tong Z等[16]报道，多种肿瘤细胞在PDT作用后，均可以观察到MAPK家族中ERKs的激活表达，使用MAPK或ERK抑制剂可以显著降低光动力作用后肿瘤细胞的存活率。研究发现PDT作用还可以诱导细胞内丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP1)的表达，其表达与ERK的激活表达相关。实验结果表明，肿瘤细胞在光动力作用后ERK的激活可以减轻光毒性作用，ERK的激活表达受MKP1调节。也有发现PDT对ERK没有影响。Tao等报道，BPD介导PDT对PAM212细胞作用中，对ERK活性没有影响。

　　人们对MAPK信号途径的激活进行了更多的研究，在相同条件下，PDT往往能够激活应激激活蛋白激酶(SAPK)/CJun氨基末端激酶(JNK)和p38/HOG1通路。SAPK/JNK和p38/HOG1在细胞对包括单态氧在内的外界刺激的应激反应中有重要作用。不论是通过cjun或是Bcl2的磷酸化，多种实验模型发现SAPK/JNK通路与凋亡诱导有关。Tong Z等[17]报道血卟啉衍生物介导PDT作用30分钟，人成纤维细胞即可出现JNK1及P38的激活表达，并能持续3小时，同时细胞存活率升高。而用表达显性负性突变p38的腺病毒进行转染的人成纤维细胞及Hela细胞则在PDT作用后细胞存活率下降。Assefa Z等研究了PDT作用中SAPK/JNK激活对凋亡诱导的影响。通过对Hela转染SAPK显性负性抑制因子SEKAL和TAM67，或使用p38通路特异抑制剂PD169316，PDT的光敏感作用显著提高。作者因而总结在血卟啉介导PDT作用中，SAPK/JNK和p38通路的激活对Hela细胞有抗凋亡的保护作用。Hendrickx N等[18]报道在血卟啉衍生物介导光动力抗肿瘤作用中，可以观察到肿瘤细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK通路的选择性激活，下游环氧化酶2(COX2)在mRNA及蛋白水平的表达上调，以及前列腺素E2(PGE2)的释放表达。P38 MAPK通路抑制剂PD169316能抑制PGE2的表达;p38 MAPK通路的激活及过度表达能够提高肿瘤细胞对光动力诱导调亡的耐受能力，提示PDT作用及p38 MAPK通路抑制剂的联合应用可以通过相应信号通路的阻断，抑制促肿瘤细胞及血管相关生长因子的释放，促进肿瘤细胞凋亡，提高抗肿瘤治疗效果。5ALA介导PDT对皮肤癌细胞的治疗中也发现JNK活性的明显升高以及p38MAPK的磷酸化。与此相反，Xue L等报道，在Pc4介导PDT中使用p38/HOG通路特异抑制剂SB202190能减少L5178YR细胞的凋亡。这种反应的不同可能与使用不同的细胞株、光敏剂和PDT损伤水平有关。

　　SAPK/JNK通路的上游调节因子尚不清楚。现在发现的一个可能的活性调节因子是神经酰胺。但目前在PDT诱导的凋亡中，SAPK/JNK通路激活的作用尚不清楚。在实验模型中，PDT诱导凋亡是一个快速的过程，SAPK/JNK通路的激活可能没有相关。目前，与PDT诱导凋亡相关的通路尚未完全建立。

　　在Pc4介导PDT对人前列腺癌LnCAP细胞作用中，发现胞浆酪氨酸蛋白激酶Etk/Bmx的表达对细胞凋亡有抑制作用。酪氨酸激酶Etk/Bmx是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的作用底物，与涉及细胞分化及生存的多个信号传导通路有关。三种相关细胞株进行了对比试验：表达低水平Etk的LNCaP细胞，高表达转染野生型Etk的LNCaP细胞以及转染显性负性表达Etk的LNCaP细胞。发现光敏作用与Etk表达水平负相关，表明Etk在PDT诱导凋亡中对LNCaP细胞有保护作用，能降低细胞凋亡率，并且Etk活性受PI3K调节，而加入PI3抑制剂能增加DNA的断裂。。显然，即使如Pc4介导PDT作用中所发现，凋亡直接因线粒体损伤诱导，也同样有其它和凋亡有关的信号传导通路的存在。Zhuang S等[19]报道，PDT作用所产生单态氧是诱导细胞凋亡的主要因素。同时还发现，PDT作用产生的其它细胞毒性活性氧物质如过氧化氢等在引起细胞死亡的同时还会刺激细胞生存相关的信号传导通路的激活，可以通过受体型酪氨酸蛋白激酶的激活可以激活Akt/蛋白激酶B信号传导通路促进细胞生存。进一步还发现其是由PI3激酶激活所致，抑制PI3激酶可以完全阻断Akt的磷酸化，并提高PDT作用后单态氧所导致的细胞死亡率。

　　此外，Games ER等[20]报道，肿瘤细胞在铝钛菁介导PDT作用后，可以观察到NO的表达增加，而NO对肿瘤细胞抗光动力效应具有保护作用。实验发现，在肿瘤细胞培养体系中加入NO可以提高PDT作用后的细胞存活率。进一步实验研究发现，这种保护作用与cGMP信号传导通路的激活相关，蛋白激酶G(PKG)抑制剂能够阻断PDT作用后NO对肿瘤细胞的保护作用。实验结果表明，肿瘤细胞在光动力作用后可能通过PKG激活导致NO产生增多，从而可以减少凋亡发生。Jiang F等报道，在光动力抗肿瘤治疗中，在不同的血卟啉衍生物浓度、不同的光照能量密度条件下，蛋白激酶C(PKC)抑制剂均可以明显提高光动力效应的细胞毒性作用。

　　如上所述，PDT能够改变一些重要调节蛋白的磷酸化水平，但是引发和维持磷酸化的直接作用很难确定。可能的解释是与紫外线诱导的EGFR磷酸化类同，活性中心含有半胱氨酸残基的磷酸酶被氧化剂或烷化剂失活，并导致不同的酪氨酸激酶的磷酸化。PDT对磷酸化的调节作用也有类似的过程和随后的相应结果。

　　4 应激蛋白

　　有研究发现PDT能诱导与细胞应激反应有关的应激蛋白的表达，但相关研究还很少。有报道在体内和体外实验中，均观察到BPD介导PDT作用后，氧化应激导致热休克蛋白(HSP)及其它应激蛋白的表达。HSP是细胞产生逃避反应中一种重要的应激蛋白，Kessel D等发现PDT能导致HSP磷酸化，抑制其磷酸化会提高细胞凋亡率;5ALA介导PDT作用能促进HL60细胞中HSP60的表达。Luna MC等报道，PDT导致的氧化应激是热休克蛋白等应激蛋白基因表达的转录诱导因素，研究人员通过试验发现，PDT介导的氧化应激能够选择性的使与HSP启动子重组的基因实现表达。

　　葡萄糖调节蛋白(GRP)是另一类非常重要的应激诱导蛋白。它能促进细胞内钙的贮藏并增强细胞对化疗药物的抵抗能力。早期研究发现，当卟啉类光敏剂孵育时间为16小时，PDT作用后可以导致GRP及HSP的表达，当孵育时间只有1小时，则PDT作用后没有上述应激蛋白的表达，这可能也是有的研究在结果存在差异的主要原因。同时Fisher AM还发现，细胞在PDT作用后对阿霉素的耐受增强，提示PDT能诱导不同的应激产物提高细胞对毒性作用的耐受能力。但也有相反的报道，Morgan J等发现，内质网上与钙结合的葡萄糖调节蛋白(GRP)在氧化应激下可诱导产生，这种应激蛋白被大家认为是细胞的一种保护因子。但在VBBO介导PDT对人上皮癌细胞作用中，GRP使细胞对PDT更为敏感，GRP的上调能够增强PDT的作用。这种差别可能与使用不同的光敏剂和细胞株有关。

　　多种应激蛋白在PDT作用后会产生或激活，并在细胞的逃避反应中具有重要作用。已有研究发现cAMP能够调节HSP的表达，但还未能对PDT作用后，各信号通路间有关逃避反应的直接联系进行研究。在PDT治疗中，肿瘤细胞的逃避反应对临床结果有重要的意义，临床可以通过药物调节特定的应激蛋白来提高PDT治疗效果。

　　总之，前面提到了光动力作用对细胞信号传导的多种影响，有的已经发现了较为明确的机制，但更多的通路还不为人们掌握，需要进行更多与临床模式相关的研究。人们在研究中普遍发现，细胞对PDT的不同反应与细胞类别、光敏剂类型、光敏剂作用部位、细胞的氧代谢状态、PDT作用强度的不同有关，光敏作用不同强度会导致不同甚至相反的生物效应，或者导致细胞产生不同的死亡方式。我们可以推测，随着对PDT作用后有关细胞逃避反应机制的深入了解，对PDT作用后信号传导通路的协同干预能够明确的提高PDT的作用疗效。

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