乳腺癌新辅助化疗对RhoE和KiSS-1表达的影响

　　作者：吕宝军,谢小铭,王晓鸿,苟新敏　　作者单位：广东珠海，中山大学附属第五医院

　　【摘要】 目的 分析乳腺癌新辅助化疗中RhoE和KiSS-1表达的变化，探讨其发生机制。方法 应用免疫组织化学法检测51例新辅助化疗组和106例对照组中乳腺癌组织标本RhoE和KiSS-1的表达。结果 新辅助化疗组和对照组乳腺癌组织中RhoE和KiSS-1的表达差异有显著性(P<0.05)，分别由对照组的20.75%和38.68%，上调到37.25%和56.86%。新辅助化疗组和对照组乳腺癌组织中RhoE和KiSS-1的表达呈正相关(P<0.05)。结论 新辅助化疗通过上调乳腺癌患者中RhoE和KiSS-1表达，抑制乳腺癌细胞的增殖、浸润和转移，促进肿瘤细胞凋亡。

　　【关键词】 乳腺肿瘤;新辅助化疗;RhoE;KiSS-1

　　【Abstract】 Objective To analyze the change of RhoE and KiSS-1 expression before and after neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients，discuss their mechanism.Methods Expression of RhoE and KiSS-1 were examined by immunohistochemical staining in 51 breast cancer samples of neoadjuvant chemotherapy group and 106 samples of control group.Results The expression of RhoE and KiSS-1 in neoadjuvant chemotherapy group(37.25% and 56.86%) were significantly more than those in control group(20.75% and 38.68%),P<0.05.RhoE had positive correlation with KiSS-1 before and afte neoadjuvant chemotherapy,P<0.05.Conclusion Neoadjuvant chemotherapy could reduce the invasion and metastasis of breast cancer through the pathway of up-regulating RhoE and KiSS-1 expression,inhibit tumor cell proliferation and encourage apoptosis.

　　【Key words】 breast neoplasm;neoadjuvant chemotherapy;RhoE;KiSS-1

　　本研究应用免疫组织化学对乳腺癌患者组织标本进行RhoE和KiSS-1蛋白的检测，分析RhoE和KiSS-1的表达与乳腺癌新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy，NCT)之间的关系及相关性，探讨RhoE和KiSS-1在乳腺癌新辅助化疗中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　从2008年1月— 2010年1月本科收治的经病理组织学确诊且术后标本蜡块保存完好的乳腺癌患者的组织标本蜡块157例作为研究对象，根据前瞻性非随机分组法分为新辅助化疗组和对照组。所有患者均为女性。所有病例术前均未接受过内分泌治疗及放射治疗，并除外双侧原发乳腺癌和合并其他恶性肿瘤病例。新辅助化疗组51例，年龄为21~63(平均46.4)岁;患者均行空心针穿刺或麦默通组织病理学检查，接受新辅助化疗3~6个周期后，行乳腺癌改良根治术或保乳术，获取标本。病理类型：浸润性导管癌41例，浸润性小叶癌8例，髓样癌2例。乳腺癌组织分化程度：高分化10例，中度分化24例，低分化17例。乳腺癌新辅助化疗方案：TA方案(紫杉醇175mg/m2第1天或多西他赛75mg/m2第1天+表柔比星60mg/m2第1天)。对照组106例，年龄为19~71(平均45.1)岁。病理类型其中浸润性导管癌81例，浸润性小叶癌13例，髓样癌7例，乳头状癌2例，黏液腺癌2例，硬癌1例。乳腺癌组织分化程度：高分化28例，中度分化57例，低分化21例。所有对照组病例术前均未接受过新辅助化疗。比较两组中位年龄和平均直径，两组资料无统计学差异。

　　1.2 方法

　　RhoE鼠抗人多克隆抗体购自Abgent公司，兔抗人KiSS-1单克隆抗体购自Santa Cruz公司，SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。采用免疫组织化学SP法，实验步骤按试剂盒说明书操作。一抗RhoE的工作浓度为1:80，KiSS-1的工作浓度为1:120。以高温高压枸橼酸盐行抗原修复，DAB显色。RhoE和KiSS-1阳性照片分别由Abgent和Santa Cruz公司提供，以PBS代替第一抗体作阴性对照。

　　1.3 结果判断标准

　　使用盲法，所有切片由两位病理科医生独立阅片。RhoE蛋白定位于细胞质中， KiSS-1位于细胞质和细胞膜，以胞浆中表达为主。阳性表达为胞浆、胞膜中出现淡黄至棕黄色颗粒。随机观察10个高倍视野，每个视野记数100个细胞，根据其中阳性细胞的比率和染色深度分别进行评估，最后综合评定。(1)按阳性细胞的比率评分：0分为阳性细胞数占总细胞数≤5%;1分为阳性细胞数占总细胞数>5%。(2)按染色深度评分：0分为细胞无棕色颗粒与背景一致;1分为细胞出现明显的棕色或棕黄色颗粒。(3)总积分=阳性细胞的比率评分+染色深度评分：0~1分为阴性(-);2分为阳性(+)。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS11.5统计软件包进行统计学分析，样本率的比较用χ2检验，RhoE和KiSS-1表达之间的相关性采用Spearman等级相关法，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 RhoE在乳腺癌中的表达

　　乳腺癌组织中RhoE主要位于细胞质，阳性表达为深棕色及棕黄色颗粒。新辅助化疗组 RhoE阳性表达率37.25%，对照组RhoE阳性表达率20.75%，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 KiSS-1在乳腺癌中的表达

　　乳腺癌组织中KiSS-1位于胞浆和胞膜中，阳性表达为深棕色及棕黄色颗粒。新辅助化疗组 KiSS-1阳性表达率56.86%，对照组KiSS-1阳性表达率38.68%，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 乳腺癌中RhoE和KiSS-1的相关性分析

　　新辅助化疗组51例乳腺癌组织中RhoE和KiSS-1阳性共表达的有16例，阴性共表达的有19例。经Spearman等级相关性分析结果显示，乳腺癌组织中RhoE和KiSS-1的表达呈正相关(r=0.513，P<0.05)。对照组106例乳腺癌组织中RhoE和KiSS-1阳性共表达的有18例，阴性共表达的有61例。经Spearman等级相关性分析结果显示，乳腺癌组织中RhoE和KiSS-1的表达呈正相关(r=0.682，P<0.05)。RhoE和KiSS-1在新辅助化疗组和对照组乳腺癌组织中的表达

　　3 讨论

　　RhoE是Rho家族的一员，Rho家族是Ras超家族中与肿瘤关系最密切的家族，Rho家族蛋白主要与细胞的生长、分化、迁移和转移有关，这些重要的生物学功能注定了它们与肿瘤的发生和发展不可分割的关系[1]。RhoE生物学功能之一就是可以调节肌动蛋白细胞骨架的重组，从而调节细胞的形态和细胞的迁移能力，在细胞的迁移和转移中具有重要的作用。采用基因芯片技术分析具有不同转移潜能的两个前列腺癌细胞系的基因表达谱,发现RhoE在具有高转移潜能的细胞系中表达水平显著增高,证实RhoE与肿瘤转移密切相关[2]。近年的研究还表明RhoE还有抗肿瘤细胞增殖的作用，许多学者RhoE认为是一种新的抑癌基因。研究发现，稳定转染RhoE的前列腺癌细胞系中CDC2和细胞周期素B1的表达受到抑制，细胞出现G2/M期阻滞和细胞凋亡,细胞生长抑制[3]。本组资料显示新辅助化疗组比对照组乳腺癌组织RhoE的表达显著增加，说明了新辅助化疗升高了RhoE的阳性表达，提示新辅助化疗促进RhoE表达，抑制乳腺癌细胞的增殖、浸润和转移，促进肿瘤细胞凋亡。KiSS-1在正常组织中有广泛表达，而在多种存在转移的肿瘤组织中表达缺失，大量研究已经证明了KiSS-1是肿瘤转移抑制基因，与肿瘤的转移密切相关。柴丽等[4]研究表明KiSS-1基因失表达与乳腺癌的淋巴结转移密切相关。本研究结果显示KiSS-1在新辅助化疗组的阳性表达明显增加，提示新辅助化疗促进KiSS-1的表达，抑制肿瘤细胞的转移。目前研究认为KiSS-1抑制肿瘤转移主要是通过其与受体结合后可激活细胞内磷脂酶介导的MAPK、ERK、Rho等信号转导途径，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，发挥抗肿瘤转移的作用。KiSS-1可通过Rho系统诱导局部黏附激酶和paxillin的磷酸化，促进细胞黏附，从而抑制肿瘤转移。我们既往的研究结果表明了在乳腺癌组织中RhoE和KiSS-1的表达呈正相关关系。本组资料显示在新辅助化疗组和对照组乳腺癌组织RhoE和KiSS-1的表达呈正相关，与既往的研究结果相符。再次表明了RhoE和KiSS-1的异常表达与乳腺癌的发生、发展、侵袭和转移有着密切的关系，同时也表明了乳腺癌新辅助化疗与RhoE和KiSS-1的阳性表达有着密切的关系。提示乳腺癌新辅助化疗与RhoE和KiSS-1的阳性表达在乳腺癌的增殖、浸润和转移过程中存在相互调节机制，其确切关系及其相互作用机制尚需进一步研究。可以推测，乳腺癌新辅助化疗通过促进RhoE的表达，上调KiSS-1的表达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖、浸润和迁移，本实验为进一步阐明RhoE在调节乳腺癌细胞增殖、侵袭及转移中的作用机制奠定了基础。总之，新辅助化疗可使乳腺癌患者的RhoE和KiSS-1阳性表达水平明显上调，RhoE和KiSS-1在新辅助化疗机制中起重要作用。乳腺癌患者中RhoE和KiSS-1的表达情况对乳腺癌规范化治疗、判断预后和提高乳腺癌术后生存率具有重要的意义。

　　【参考文献】

　　1 Etienne-Manneville S，Hall A.Rho GTPases in cell biology.Nature，2002，420(6916):629-635.

　　2 Trojan L，Schaaf A，Steidler A，et al.Identification of metastasis associated genes in prostate cancer by genetic profiling of human prostate cancer cell lines.Anticancer Res，2005，25(1A):183-191.

　　3 Bektic J，Pfeil K，Berger A P，et al.Small G-protein in RhoE is under expressed in prostate cancer and induces cell cycle arrest and apoptosis.Prostate，2005，64(4): 332-340.

　　4 柴丽，石林祥，房林，等.KiSS-1基因及其受体在乳腺癌中的表达及临床意义.中华实验外科杂志，2005，22(9):1068-1070.