VEGF 反义寡核苷酸抑制胆囊癌生长增殖和凋亡的体外实验研究

　　作者：庞作良,李海军,毛拉艾沙•买买提　　

　 【摘要】目的体外研究Oligofectamine介导的VEGF 反义寡核苷酸转染对胆囊癌GBCSD细胞生长、增殖和凋亡的影响。方法运用Oligofectamine介导VEGF 反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides，ASODN)和错义寡核苷酸(Scrambled Oligodeoxynucleotide，SODN)转染人胆囊癌GBCSD细胞，MTT法测定转染后各组细胞的生长曲线及抑制率，流式细胞术检测转染后不同时间各组细胞凋亡情况。结果SODN、SODN+Oligofectamine对GBCSD细胞生长无显著影响 (P>0.05)，而ASODN及ASODN+Oligofectamine则能显著抑制细胞生长 (P<0.05)，且ASODN+Oligofectamine对细胞生长增殖抑制作用较ASODN组更为强(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现ASODN+Oligofectamine能促进GBCSD细胞凋亡(P<0.05)。结论VEGF ASODN转染能抑制胆囊癌GBCSD细胞生长和增殖，Oligofectamine介导能明显增强VEGF ASODN的抑制作用;Oligofectamine介导VEGF 反义寡核苷酸转染能促进胆囊癌GBCSD细胞的凋亡。

　　【关键词】 胆囊癌细胞株GBCSD;VEGF;反义寡核苷酸;Oligifectamine;凋亡

　　Experiment of Oligofectamine Mediated VEGF ASODN Transfection on GBCSD Cell Growth, Proliferation and Apoptosis in Vitro

　　PANG Zuoliang, LI Haijun, MAIMAITI Maolaaisha

　　Department of Hepatobilopancreatic Surgery,Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University,Urmqi 830011, China

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of oligofectamine mediated VEGF ASODN transfection on GBCSD cell growth, proliferation and apoptosis in vitro. MethodsGBCSD cells were transfected with VEGF ASODN and SODN mediated by oligofectamine. The change of transfected GBCSD cells growth and proliferation activity by MTT, and apoptosis by flow cytometry were assessed. ResultsThe transfected GBCSD cells growth and proliferation activity tested in groups of SODN and SODN+oligofectamine had no difference as compared with control group(P>0.05), but as for the cells of ASODN and ASODN+oligofectamine, the growth and proliferation activity were significantly inhibited(P<0.05), moreover, the effect of ASODN+oligofectamine was more significant than that of ASODN(P<0.05). The results of flow cytometry revealed ASODN+oligofectamine could accelerate transfected GBCSD cells apoptosis(P<0.05). ConclusionVEGF ASODN could inhibit GBCSD cells growth, proliferation and accelerate apoptosis. The oligofectamine could strengthen the effect of ASODN.

　　Key words：GBCSD cell;VEGF;ASODN;Oligifectamine;Apoptosis

　　0引言

　　VEGF通过与其特异性受体(VEGFR)结合，刺激血管内皮细胞增殖和迁移，促进新生血管生成，在肿瘤的生长和转移中起重要作用。抑制VEGFR信号转导通路的任何一个环节，就可能防止肿瘤的进展与转移。ASODN因有专一序列的寡聚脱氧核苷酸，故能特异阻断靶基因的复制、转录和翻译，是目前迅速发展的一种新型的基因治疗药物[1]。Oligofectamine是一种专门用于寡核苷酸转染的阳离子脂质体，具有较高转染率。本实验体外运用Oligofectamine介导的VEGF ASODN转染人胆囊癌GBCSD细胞, 通过MTT和流式细胞术观察VEGF ASODN对GBCSD细胞生长增殖和凋亡的影响。

　　1材料和方法

　　1.1材料人胆囊癌细胞株GBCSD(中科院上海细胞生物学研究所)，四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(宝泰克公司)，ANNEXINV/PI凋亡试剂盒(CALTAG公司)，OligofectamineTM Reagent(20μM)(Invitrogen公司)，VEGF反义寡核苷酸、VEGF错义寡核苷酸(上海生工生物工程公司)，流式细胞仪(FACScan型)(美国BD公司)。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养人胆囊癌GBCSD细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液 (含青霉素和链霉素各100μg/ml)， 37℃，5%CO2培养箱培养。 待细胞长满瓶底70%～80%时采用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化传代，3～4天传代1次，取传代后24～48h处于指数生长期的细胞备用。细胞经0.4%台盼蓝染包，拒染率>95%。

　　1.2.2寡核苷酸合成VEGF反义寡核苷酸及错义寡核苷酸序列参照文献[2], VEGF反义寡核苷酸(ASODN)序列为: 5′TGGCTTGAAGATGTACTCGAT3′，VEGF错义寡核苷酸 (SODN)序列为：5′TACGTAGTATGGTGTACGATC3′，全硫代修饰，保存于-70℃待用。OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染参照oligofectamineTM Reagent 说明书和文献进行[35]。

　　1.2.3四甲基偶氮唑蓝(5diphenyl tetrazolium bromide，MTT)法检测 SODN和OligofectamineTM对GBCSD细胞的毒性试验实验设对照组，2.5、5、10和20μmol/L SODN组及0.5、1、2和4μl Oligofectamine组。GBCSD细胞37℃，5%CO2培养箱培养24h后，无血清RPMI1640换液，并分别加入SODN(终浓度为2.5、5、10和20μmol/L)和0.5、1、2和4μl Oligofectamine。12、 24、48和72h 后，用MTT法检测细胞活力，并绘制各组细胞的生长曲线。

　　1.2.4OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染指数生长期GBCSD细胞，以5×103/ml细胞密度接种96孔板中。混合5μl Oligofectamine和10μl 20μM SODN或10μl 20μM ASODN，制备成无血清转染液，并加入细胞中，培养4h后，吸弃转染液，加入含小牛血清培养液继续培养，此时设为0h点。

　　1.2.5MTT法检测OligofectamineTM 介导VEGF寡核苷酸转染对GBCSD细胞增殖的影响OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染如前所述。分别于转染后24、48、72和96h后，加入MTT (5mg/m1)20μl，37℃，5%CO2培养箱温育4h，小心吸去上层培养液，每孔加入200μl的二甲亚砜(DMSO)终止反应，在570nm波长下检测吸光度。以时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制细胞生长曲线并计算细胞生长的抑制率。

　　1.2.6流式细胞仪检测OligofectamineTM 介导VEGF寡核苷酸转染对GBCSD凋亡的影响OligofectamineTM介导的寡核苷酸转染如前所述。分别于转染后24、48、72和96h后，按照ANNEXINV/PI凋亡试剂盒操作说明，采用流式细胞仪进行检测。

　　1.3统计分析实验数据中计量资料以± s表示，多组资料的统计学检验采用方差分析，各组均数间的相互比较采用 StudentNewmankeuls法，所有统计学检验均采用统计学软件SPSS 11.0 进行，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1MTT法测定SODN和OligofectamineTM对GBCSD细胞的毒性试验在12、 24、48和72h 4个作用时相点，对照组，2.5、5、10和20μmol/L SODN组及0.5、1、2和4μl oligofectamine组GBCSD细胞生长无明显差异(P>0.05)，可见在试验浓度范围内，SODN和Oligofectamine对GBCSD细胞均未见明显毒性。

　　2.2MTT法检测OligofectamineTM 介导VEGF寡核苷酸转染对GBCSD细胞增殖的影响SODN组、SODN+Oligofectamine组和Oligofectamine组的细胞生长曲线与对照组基本平行，四组相比差异无统计学意义(P>0.05)。ASODN组及ASODN+Oligofectamine组与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05)，且ASODN+Oligofectamine组GBCSD细胞的生长曲线比ASODN组低平，表明ASODN组及ASODN+Oligofectamine组的GBCSD细胞生长增殖均受到明显抑制，而SODN组、SODN+Oligofectamine组和Oligofectamine组的GBCSD细胞与对照组相比无明显差别，ASODN组的抑制增殖作用于培养24~48h左右最明显，抑制率在35%上下，在48h后抑制作用开始逐渐减弱，而ASODN+Oligofectamine组的抑制增殖作用比ASODN组更显著, 抑制率在24~96h内均达50%以上，显著高于ASODN组(P<0.05)。该结果表明，VEGF ASODN能抑制GBCSD细胞的增殖速率, 通过Oligofectamine介导转染，能增强VEGF ASODN转染对GBCSD细胞增殖的抑制作用。

　　各组对GBCSD细胞生长曲线的影响

　　VEGF ASODN和ASODN+Oligofectamine对GBCSD细胞生长的抑制率

　　*与ASODN组比较P<0.01

　　2.3流式细胞仪检测OligofectamineTM 介导VEGF寡核苷酸转染对GBCSD凋亡的影响图中左下象限为AnnexinV(-)PI(-): 无凋亡的活性细胞;右下象限为AnnexinV(+)PI(-): 早期凋亡细胞;右上象限为AnnexinV(+)PI(+): 晚期凋亡细胞、坏死或已死细胞。本检测结果显示Control组和SODN+Oligofectamine组24、48和72h细胞大部分为左下象限无凋亡的活性细胞 , 仅有少量为凋亡及死亡细胞。Control组的24、48和72h无凋亡活性细胞分别占95.20%、94.20%和94.43%, 凋亡及死亡细胞仅占3.86%、4.75%和4.83%, SODN+Oligofectamine组的24、48和72h无凋亡活性细胞分别占94.30%、93.63%和92.10%, 凋亡及死亡细胞仅占4.54%，5.46%和6.91%, Control组和SODN+Oligofectamine组之间无凋亡活性细胞和凋亡及死亡细胞差异均无统计学意义(P>0.05)，说明24、48和72h Control组和SODN+Oligofectamine组GBCSD细胞均无明显的凋亡发生, 具有充分的活性。但ASODN+Oligofectamine组细胞凋亡及死亡细胞，在24、48和72h分别占24.73%,52.42%和65.09%，较Control组和SODN+Oligofectamine组有明显增加(P<0.05),而左下象限无凋亡的活性细胞分别占73.34%、46.93%和33.75%，则显著低于Control组和SODN+Oligofectamine组(P<0.05)。说明ASODN+Oligofectamin组细胞与Control组和SODN+Oligofectamine组细胞相比凋亡更为明显, 提示ASODN+Oligofectamin组能促进胆囊癌GBCSD细胞的凋亡。

　　各组GBCSD细胞凋亡情况

　　3讨论

　　针对癌基因、生长因子及其受体、信号传导通路等设计的ASODN已作为一种有希望的药物用于治疗癌症等 [6]。由于未经修饰的ASODN进人细胞内很快被降解，经修饰或载体结合后降解速度大为减慢，为此人们合成了许多具有核酸酶抗性的寡核苷酸类聚物，经过修饰的反义寡核苷酸, 抵抗核酸酶的消化能力大大提高, 从而提高了细胞内ASODN分子的浓度, 延长了反义寡核苷酸的有效作用时间，为此，在本研究所采用的寡核苷酸就是人工合成的全硫代修饰的SODN和ASODN。ASODN在实际应用时存在着细胞摄入率低的问题，单纯提高ASODN的用量，不仅增加了费用，而且可能会产生非特异性的毒副作用[7]。已证实阳离子脂质体可提高ASODN与细胞的结合能力，增强其生物学活性[89]。研究表明[10]，在Iiposome介导下，血液循环中的ASODN至少在24 h内保持完整，而单纯ASODN 5 min后将不能被检测到。ASODN与脂质体结合后，主要集中在细胞核，而单纯的ASODN则主要位于胞浆中。结合改变了其在细胞内的分布，使ASODN在细胞核内的作用时间延长。阳离子脂质体(Cationic liposomes)能与带负电荷的核酸物质形成复合物，可提高细胞对ASODN的摄入，增加生物利用度，同时可在一定程度上降低核酸酶对其的降解 [1112], 如市售的Lipofectamine，它带阳离子，可以包裹带阴离子的寡核苷酸，转染效率也很高[1314]。在本实验中我们所使用的Oligofectamine是一种专门用于寡核苷酸转染的阳离子脂质体，其转染效率优于Lipofectamine[15]。从我们的实验结果显示，SODN和Oligofectamine对人胆囊癌细胞GBCSD的正常生长在实验浓度范围内没有任何毒性作用，在此基础上，通过MTT法测得的细胞生长曲线发现，ASODN组和ASODN+Oligofectamine组对人胆囊癌细胞GBCSD的生长有显著的抑制作用，而SODN组和SODN+Oligofectamine组则无作用，表明VEGF反义寡核苷酸能显著抑制人胆囊癌细胞GBCSD的增殖。而Oligofectamine包裹介导转染的ASODN组较直接转染的ASODN组抑制率明显提高，且作用有效时间延长，在96 h仍有显著抑制作用。流式细胞仪检测的检测结果说明ASODN+Oligofectamin组能促进胆囊癌GBCSD细胞的凋亡。可见VEGF ASODN能够阻断其在促进肿瘤新生血管生成通路的信号转导，能够抑制胆囊癌细胞GBCSD生长增殖，促进细胞凋亡，Oligofectamine作为一种专门用于寡核苷酸转染的阳离子脂质体，能显著提高VEGF ASODN抑制人胆囊癌细胞GBCSD的增殖效应，并且这种作用是序列特异性的，而不是脂质体本身的作用或非序列特异性效应。因此Oligofectamine可作为一种低毒载体应用于介导ASODN对胆囊癌的治疗。综上所述，VEGF ASODN能抑制胆囊癌GBCSD细胞的生长和增殖，Oligofectamine能明显增强VEGF ASODN的抑制效果。Oligofectamine+ASODN能促进胆囊癌GBCSD细胞的凋亡。

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