噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中的应用和优化

　　作者：徐泱,孙惠川,汤钊猷,樊嘉,周俭,钦伦秀　　作者单位：200032 上海，复旦大学附属中山医院肝外科、复旦大学肝癌研究所

　　【摘要】目的克服体内噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中应用的技术障碍。方法 采用噬菌体体内分布及代谢实验研究噬菌体在裸鼠体内的分布及代谢规律，比较噬菌体饱和灌注、聚肌苷(Poly Ⅰ)及不同的活体灌洗技术对组织中噬菌体分布的影响。结果 肝脏等网状内皮系统器官可非特异性结合噬菌体。这种结合可被空白噬菌体饱和灌注所抑制(P<0.01)，而Poly Ⅰ无显著影响(P>0.05)。左、右心室加门静脉灌洗较单纯左心室灌洗可显著减少组织血管中血液及未结合噬菌体的残留(P<0.01)。结论 经过改进优化的体内噬菌体展示技术可为肝癌肿瘤血管异质性研究提供稳定、高效的技术平台。

　　【关键词】 噬菌体展示; 肝肿瘤; 肿瘤血管; 异质性

　　Application and optimization of in vivo phage display in study of vascular heterogeneity in hepatocellular carcinoma XU Yang, SUN Huichuan, TANG Zhaoyou, FAN Jia, ZHOU Jian, QIN LunXiu, LIU Yinkun. Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

　　【Abstract】 Objective To circumvent the obstacle of in vivo phage display for study of vascular heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Methods The distribution and metabolic law of phage in the athymic mouse was detected by using in vivo phage display and metabolic experiment to compare the effects of f1tet phage presaturation, Poly Ⅰ preinjection and modified perfusion on distribution of phage in the tissues. Results The nonspecific phage trapped by liver (belonged to the reticuloendothelial system, RES) was decreased significantly by presaturation of filamentous insertless phage (P<0.01), but not affected by the preinjection of Poly Ⅰ (P>0.05).Left and right ventricle plus portal vein lavage could more significantly decrease blood volume in the vessels and residuals of untrapped phage (P<0.01). Conclusion The modified in vivo phage display offers an ideal method for study of vascular heterogeneity in hepatocellular carcinoma.

　　【Key words】 Phage display; Liver tumors; Tumor vasculature; Heterogeneity

　　肿瘤血管“异质性”是血管生成研究中的热点。噬菌体文库体内展示技术在1996年一出现，就立刻成为血管异质性研究的理想工具[1-2]。现在，应用噬菌体展示体内筛选技术已得到针对不同组织或肿瘤血管的特异性靶向分子[3-4]。但肝、脾等属于网状内皮系统的器官能够非特异性地吞噬或吸附噬菌体，而一直未有相关报道[5]。本研究的主要目的是探讨克服肝脏对噬菌体文库非特异性吞噬或吸附的方法，建立稳定、高效的肝癌噬菌体文库体内展示技术平台，为肝癌肿瘤血管异质性研究提供强有力的工具。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物： 6周龄雄性BALB/c裸鼠， 平均15～20 g，购自中科院上海药物所，饲养在25 ℃恒温SPF级层流室，12 h光照和12 h黑暗交替，自由进食标准颗粒饲料及饮水。

　　1.1.2 噬菌体文库：Ph.D.7噬菌体随机7肽库及M13mp19空白对照噬菌体购自美国NEB公司(Cat.No. E8100S;N4019S)，f1tet空白噬菌体由中科院上海生物化学研究所惠赠。

　　1.1.3 其他试剂：聚肌苷(Poly Ⅰ)及兔抗M13噬菌体抗体购自美国Sigma公司(Cat.No. 81354;B7786)，ABC免疫组化试剂盒购自上海华美生物工程公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肝癌原位种植裸鼠模型制备：按照我所李雁等[6]方法在雄性BALB/c裸鼠上制备高转移人肝癌原位种植模型。

　　1.2.2 噬菌体文库体内展示常规流程：动物麻醉后予尾静脉注射噬菌体。5～8 min后活体心脏灌洗。灌注结束后切下目标组织及对照组织，匀浆后反复洗涤，加入宿主细菌(ER2738大肠杆菌)复苏组织中的噬菌体测定滴度。目标组织中的噬菌体扩增后作下一轮筛选之用。

　　1.2.3 抗噬菌体免疫组化染色：染色方法按试剂盒说明书ABC法进行：组织切片常规脱蜡至水，3% H2O2室温处理10 min，微波抗原修复2次共8 min，加10%山羊血清37 ℃ 20 min;加1∶1 000稀释的兔抗M13噬菌体抗体室温1 h;PBS洗3次各5 min;滴加1∶500稀释的羊抗兔生物素化二抗37 ℃30 min;PBS洗3次各5 min;滴加ABC液37 ℃ 30 min，PBS洗3次各5 min;滴加DAB显色液;PBS冲洗3 min中止;苏木素复染、脱水、中性树胶封片。结果观察：细胞膜或胞质内出现棕黄色颗粒阳性染色，如阳性颗粒数少于每高倍视野3处判为阴性，反之则为阳性。每次均以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.4 噬菌体体内分布及代谢实验：荷肝癌裸鼠分为12组，每组4只，0.5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，其中一组经尾静脉注入1×1012 pfu的M13空白噬菌体，分别在1、4、10、30 min、1、2、6、12、24、48及72 h后活体心肝灌洗;另一组在注射1×1012 pfu的文库噬菌体4 min后活体心肝灌洗。灌洗结束后，立刻取出肿瘤及对照组织(肝脏、肺、肾脏、脑)剪碎匀浆、洗涤离心后称重，加100 μl 1%的NP40冰浴5 min使细胞溶解;加900 μl的ER2738大肠杆菌培养液室温下共育20 min。将共育物全部倒入内有9 ml LBT培养液的50 ml离心管中室温下共育30 min，测定单位组织中噬菌体滴度。其余组织予常规固定、石蜡包埋、切片，抗噬菌体免疫组化染色观察噬菌体在组织中的分布。

　　1.2.5 活体灌洗技术比较实验：荷肝癌裸鼠分为2组，每组4只，麻醉后经尾静脉注射1×1012 pfu的M13空白噬菌体。7 min后，一组以常规灌洗方法进行活体灌洗，即将注射器针头插入左心室以2 ml/min的速度灌注20 ml的PBS，灌注开始后立即剪开右心房;另一组在灌洗PBS液中加入一定量的肝素(50 U/ml)，在左心室灌注完后，再灌洗右心室，慢速(2 ml/min)灌洗20 ml，随后穿刺门静脉，以5 ml/min继续灌洗20 ml。灌洗结束后应看到肝、肿瘤、肺、肾等完全均匀变白。切取肝脏、肿瘤及其他对照组织，复苏各组织中结合的噬菌体测定滴度。

　　1.2.6 Poly Ⅰ抑制实验：荷肝癌裸鼠分为6组，每组4只。Poly Ⅰ(200、350及500 μg/100 μl PBS)3个剂量组和PBS对照组，均在注射1×1012 pfu的M13空白噬菌体前5 min预先经尾静脉注入裸鼠体内;另2组在静脉注射500 μg Poly Ⅰ(或100 μl PBS)后5 min，尾静脉注射1×1012 pfu的文库噬菌体。噬菌体注射7 min后活体心肝灌洗，切取肝脏、肿瘤及其他对照组织，复苏各组织中结合的噬菌体测定滴度。

　　1.2.7 噬菌体饱和灌注实验：荷肝癌裸鼠分为18组，每组2只，M13空白噬菌体或f1tet空白噬菌体各9个剂量组(1×106～1×1014 pfu，10倍梯度增加)，分别注入裸鼠体内，7　min后切取肝脏和肿瘤，复苏其中结合的噬菌体测定滴度。荷肝癌裸鼠分为4组，每组4只，在注入1×1012 pfu的文库噬菌体(或M13空白噬菌体)前5 min将1×1012 pfu的f1tet空白噬菌体(或PBS)经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内，在噬菌体注射7 min后活体心肝灌洗，切取肝脏、肿瘤及其他对照组织，复苏各组织中结合的噬菌体测定滴度。

　　1.3 统计学分析

　　数据用SPSS 11.0处理，结果以±s表示。单因素方差分析比较各组内参数差异，配对资料采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 噬菌体体内分布及代谢实验

　　肝脏可大量非特异性地结合血液循环中的噬菌体，其结合的噬菌体较其他器官(组织)高约10～1 000余倍，肿瘤亦有非特异性结合噬菌体的能力。噬菌体主要经肝肾代谢，噬菌体在血液中的代谢周期约为72 h。在注射噬菌体后4 min，从肝脏与肿瘤中复苏的文库噬菌体与M13噬菌体的数量比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在其他组织中差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 不同活体灌洗技术的比较

　　改良灌洗组，肝、肿瘤、肾、肺组织中的M13空白噬菌体数较传统灌洗组显著降低(肝、肿瘤、肾脏：P<0.05;肺：P<0.01)，平均下降到10%左右(图4)。活体灌洗并不影响噬菌体增殖活性。

　　2.3 Poly Ⅰ抑制实验

　　注射M13噬菌体及文库噬菌体的Poly Ⅰ各剂量组与PBS对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.4 噬菌体饱和灌注实验

　　肝脏及肿瘤中结合的噬菌体数量随f1tet空白噬菌体注入量的增大而逐渐增加，但当注入噬菌体≥1012 pfu后，肝脏及肿瘤中结合的噬菌体数量就稳定保持在1011 pfu及106 pfu而不再增加;M13与f1tet噬菌体变化基本一致。经过量的f1tet空白噬菌体(1012 pfu)预饱和后，肝脏、肿瘤、肾脏、肺及脑组织与M13空白噬菌体的结合均显著被抑制(肝、肿瘤、肾、肺：P<0.01;脑：P<0.05);肝脏、肿瘤、肾脏及肺组织结合文库噬菌体较PBS对照组亦显著减少(P<0.01)，肝脏所结合噬菌体与其他组织的差异明显减少。

　　3 讨论

　　越来越多的证据表明，肿瘤血管生成在肿瘤生长、转移和复发的各个环节均有重要作用[7-8]。肿瘤血管具有不同于正常血管的“异质性”也已逐渐取得共识[9]。肿瘤血管研究方面的进展，都离不开研究技术手段的进步。其中噬菌体文库体内展示技术在“血管异质性”研究方面发挥了重要的作用。噬菌体展示技术由美国Smith[10]在1985年首先报道，其原理是将序列不同而长度相同的合成寡核苷酸插入到噬菌体衣壳蛋白基因序列之中，外源多肽就可以表达在噬菌体衣壳蛋白的表面，由此就可能生成巨大的、可以展示数千万个肽的重组噬菌体文库。1996年，Pasqualini又在噬菌体文库体外展示技术的基础上发展出噬菌体文库体内展示技术[1]，即把噬菌体文库注入动物体内，直接在血管内(或体腔内)筛选可与靶器官或组织的血管表面分子(或体腔的表面分子)特异结合的噬菌体，进而得到噬菌体表面展示的具靶向作用的多肽分子。现在，应用噬菌体展示体内筛选技术已得到针对许多肿瘤及一些血管生成相关疾病的特异性靶向分子。这些靶向分子可用于显示肿瘤血管或利用特异靶向分子阻断生长因子配体与受体结合，或携带细胞毒性药物攻击肿瘤的干预治疗研究等[11-12]。

　　肝脏是血窦最为丰富的器官之一。肝癌中的肿瘤血管不仅丰富而且复杂，但却极少有关于肝癌肿瘤血管异质性的研究报道。这其中一个很重要的原因是缺乏有效的研究方法。虽然已有一些应用免疫磁珠分选等方法分离肿瘤血管内皮细胞的成功报道[13]。但在肿瘤内皮细胞的分离过程中，必不可少的各种消化酶的应用必然会使血管内皮表面的蛋白分子受到损失。此外，免疫磁珠分选过程就可能将具有血管特异性分子但却不表达筛选所用免疫分子的血管内皮细胞亚群给筛选去除了。即使能够成功分离到肿瘤血管内皮细胞，但从理论上来说，分离出来的肿瘤血管内皮细胞脱离了原来生长的器官及肿瘤微环境，特别是再经过体外的传代培养，它原有的异质性就有可能逐渐消失甚至将不复存在了。噬菌体体内展示技术虽然提供了一个在体内原位研究血管异质性的技术平台，但在肝脏(肿瘤)血管异质性研究上却从未有报道。其原因是因为肝脏是一个网状内皮系统器官，其血管内皮具有强大的吞噬和吸附能力，也因此而成为噬菌体文库体内展示技术应用的少数几个“盲点”之一。

　　为克服噬菌体文库体内展示技术在肝脏中应用上的障碍，我们首先研究了噬菌体在体内的分布及其代谢规律。肝脏可以大量地吞噬和吸附噬菌体，而肿瘤组织内结合的噬菌体数量虽然没有其他对照组织多，但却同样是“无差别”地对文库噬菌体和空白噬菌体进行结合吞噬。实验结果似乎表明，肝癌肿瘤血管“异质性”无法用“噬菌体文库体内展示”这样的体内原位研究技术来揭示。但基于我们最初的假设，肝癌肿瘤血管应有其特有的分子标志，文库噬菌体所展示的数以亿计的多肽中必有一些可以成为这些肝癌肿瘤血管标志分子的配体，只是这些展示特异多肽配体的噬菌体被淹没在数量上大大超过它的其他非特异噬菌体的“海洋”中了。要富集得到这些特异噬菌体，就必须有办法排除非特异性噬菌体的干扰。

　　已有研究报道，网状内皮系统对噬菌体的非特异性吸附和吞噬是由表面大量存在的清道夫受体所执行，并能被清道夫受体抑制剂Poly Ⅰ所抑制，由此成功应用噬菌体文库体内展示筛选到针对同样属于网状内皮系统的骨髓血管内皮的靶向多肽[14]。但我们在实验中发现，即使是用文献报道的一倍剂量的PolyI对裸鼠进行预注射，也不能显著降低肝脏及肝癌对空白噬菌体的非特异性吞噬，从而也就无法实现筛选肿瘤血管特异性噬菌体的目标。我们考虑，肝脏和骨髓虽然同属于网状内皮系统，但肝脏血窦内皮所执行的清除外源异物功能却较骨髓要强大得多，对噬菌体的非特异性吞噬可能有除了清道夫受体之外更多的受体参与，或根本不经过受体介导，直接由内皮间隙进入肝实质中。因而单靠抑制一种或几种清道夫受体，显然就难以将其吞噬功能抑制掉。

　　我们再次提出假设：如同神经突触的传导功能会因为突触间隙过量胆碱的释放而被暂时抑制一样，肝脏(肝癌)对噬菌体(或其他异物)的吞噬也可能被注射到体内的超量的噬菌体(或异物)所饱和，从而功能受到抑制。为了验证这个假设，我们将不同剂量的空白噬菌体从尾静脉注射到裸鼠体内，7 min后检测肝脏和肿瘤中的噬菌体含量。我们发现肝脏和肿瘤对于噬菌体的吸附存在一个上限，当注入的噬菌体达到1012 pfu后，短期内从组织中复苏的噬菌体滴度就不再升高，而一直稳定保持在同一个水平。基于以上结果，我们选用一种空白噬菌体f1tet噬菌体来对肝脏网状内皮进行饱和灌注。这种f1tet噬菌体与我们筛选所用的M13mp19文库噬菌体在结构和外形上完全一致，除了没有在衣壳上展示外源多肽，它的基因组中还缺少了LacZα基因，因而在含有IPTG/Xgal的LBT平板上就会显示为白色噬菌斑，从而可以很方便的与显示蓝色噬菌斑的文库噬菌体区分开来。进一步的实验表明，过量的f1tet噬菌体预饱和灌注抑制了肝脏对M13mp19空白噬菌体(噬菌体文库的空白载体)的非特异性结合，文库噬菌体与空白噬菌体在肝脏等器官结合率的差异经f1tet噬菌体预饱和后被成功显露了出来。

　　除此之外，噬菌体体内展示中活体灌洗步骤对结果也有着显著的影响，除了正确的活体心脏灌洗技术如灌洗针进针部位、深度以及灌洗速度等需要很精确地掌握之外，我们发现，单以传统的左心室灌洗很难将肝脏和肿瘤中的血液完全灌洗干净。这是因为肝脏接受肝动脉及门静脉双系统的血液供应，门静脉系统的血液很难通过左心室灌洗完全清除干净，而残留的血液对噬菌体展示的结果有着很大的影响。于是我们在左心室灌洗之后，增加了右心室灌洗及直接经门静脉灌洗，同时在灌洗液中加入了一定量的肝素以防止血液在小血管中发生凝结。实验结果显示，改进后的活体灌洗技术使肝脏、肿瘤等组织中复苏的噬菌体较传统灌洗方法平均下降到10%左右。改良活体灌洗技术显著提高了噬菌体文库体内展示的效率，且对噬菌体的活力没有显著影响。

　　总之，通过空白噬菌体预饱和灌注、改进活体灌注等方法，我们成功地克服了肝脏(肝癌)对噬菌体的非特异性吞噬或吸附。经过改进优化的体内噬菌体展示技术完全可为肝癌肿瘤血管异质性研究提供一个稳定、高效的技术平台。

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