晚期非小细胞肺癌患者外周血DC亚型与 NK细胞的关系

　　作者：郑红刚　　作者单位：北京，中国中医科学院广安门医院肿瘤科

　　【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌患者外周血树突状细胞亚群(DC1/DC2)和机体NK细胞含量之间的关系及其临床意义。方法 采用流式细胞术检测40例肺癌患者外周血DC亚群(CD11c+DC/DC1和 CD123+ DC/DC2)、NK细胞含量及血浆IL12的浓度， 并以10例健康受试者作为对照。结果 肺癌患者外周血CD11c+DC百分率为(0.66±0.24)%，比对照组(1.38±0.18)%明显降低(P<0.01)，CD123+ DC百分率(0.28±0.17)%与对照组(0.27±0.11)%相比， 差异无统计学意义(P>0.05);肺癌患者与健康人比较，NK细胞含量及IL12的浓度均降低(P<0.05)。NSCLC 患者NK细胞的含量与CD11c+百分数及血浆IL12 浓度均呈正相关(P<0.05)，与CD123+百分数呈负相关(P<0.01)。DC各亚型百分率同患者的卡氏评分、化疗史有关联(P<0.01)，NK细胞的含量与年龄相关(P<0.05)。结论 非小细胞肺癌患者DC1功能低下，IL12分泌能力障碍，从而影响了NK细胞的活性。DC亚型与NK细胞含量之间以及它们与临床生物学行为之间都有一定关系。

　　【关键词】 非小细胞肺癌 树突状细胞亚群 自然杀伤细胞

　　树突状细胞(Dendritic cell，DC)是一种专职的抗原提呈细胞， 依据 DC起源和功能，将人外周血 DC 分为两个亚群[14]。自然杀伤(Nature killer，NK)细胞在机体免疫中地位重要，外周血NK细胞的变化是反映机体细胞免疫状态的重要指标[5]。晚期非小细胞肺癌患者DC亚群的表达水平如何，它同患者机体NK细胞的关系如何，以及此二者同步检测的临床意义究竟如何，目前尚无定论。本研究对40例晚期非小细胞肺癌患者的DC亚群和机体免疫状态进行了同步检测和分析，现总结报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例选择

　　收集符合纳入标准的非小细胞肺癌患者40例，对照组10例，均为健康受试者。

　　1.1.1 纳入标准 (1)有明确病理诊断的III～IV期非小细胞肺癌患者;(2)心、肝、肾和造血系统功能基本正常;(3)预计生存期在6个月以上;(4)Karnofsky评分≥60分。

　　1.1.2 排除标准 (1)无明确病理诊断者;(2)预期生存期<6个月者;(3)合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病;(4)儿童、孕妇和精神病患者。

　　1.2 一般资料

　　按照上述条件共纳入40名患者，均为我科2006年8月～2006年12月期间的住院病人。其中男27例，女13例;年龄38～82岁，中位年龄63岁; III期15例，IV期25例;病理类型：腺癌23例，鳞癌17例。

　　1.3 试剂与仪器

　　免疫荧光三标记 DC 检测试剂盒(3color dendritic value bundle)购自美国 Becton Dickson 公司，内有FITC标记的 Lineage Cocktail 1 (Lin1)，由CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56系列抗原混合单抗组成， CD11cPE、CD123(抗IL3R)PE，抗HLADRPerCP及 阴 性 同 型 对照小鼠IgG1PE/IgG2PE;FITC或PE标记鼠抗人CD3-并CD16/CD56+单克隆抗体，FACS Calibur流式细胞仪(美国 Becton Dickson公司生产)，离心机等。

　　1.4 测定指标与方法

　　1.4.1 外周血 DC1/DC2 亚型的检测 参考文献[6]，取肝素抗凝外周血500μl，分装4管， 每管100μl全血， 加入Lin1、抗HLADRPerCP、CD123(抗IL3R)PE、CD11cPE及阴性对照IgG1PE/IgG2PE单抗，振荡混匀，室温暗处反应15min，加入2ml溶血素，混匀、裂解10min，离心弃上清，洗涤1次，加入300μl的1%多聚甲醛溶液，用FACS Calibur流式细胞仪每管收集50000个细胞，FSC设阈值，排除碎片干扰，用Cell Quest 软件获取及分析HLADR/Lin1点图中的HLADR阳性、Lin 1弱阳性和阴性的细胞群体，以CD11c和CD123荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。

　　1.4.2 NK细胞的检测 参考文献[7]，用FITC或PE标记鼠抗人CD3-并CD16/CD56+单克隆抗体，由流式细胞仪测定外周血中NK细胞含量。

　　1.4.3 血浆IL12浓度检测 按照IL12试剂盒的操作说明进行： 于96孔酶标板中每孔加入Assay Diluent RDIF 50μl，各孔中分别加入已配制的IL12标准液或已经室温融化并离心的血浆样本200μl，室温静置2h，弃上清液并用Washer Buffer洗涤3次，各孔中加入200μl IL12结合物，室温静置2h，弃上清液并用Washer Buffer洗涤3次，加入200μ1底物溶液，室温避光静置20min，加入50μl终止液，静置25min后上酶标仪(450nm)读取OD值，绘制标准曲线并求出各标本的血浆IL12浓度。

　　1.5 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计分析软件对实验数据进行统计，采用两样本均数差别的秩和检验、双变量相关分析及偏相关分析。

　　2 结果

　　2.1 外周血中树突状细胞亚型的检测

　　肺癌患者外周血髓系树突状细胞(MDC，CD11c+)的表达与正常对照组比较显著降低(P<0.01)，淋巴系树突状细胞(LDC，CD123+)的表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。肺癌患者与健康对照组外周血树突状细胞亚型的检测结果

　　2.2 外周血中NK细胞活性及血浆IL12浓度的检测

　　检测结果显示，NSCLC 患者血浆IL12 浓度为(3.19±0.30)pg/ml， 显著低于正常人(8.21±1.80)pg/ml (P=0.000)。NSCLC患者与健康人比较，NK细胞的杀伤能力减弱，其含量为(15.51±2.15)%，低于健康对照组的(22.53±15.25)%(P=0.018)。

　　2.3 NSCLC患者树突状细胞亚型、IL12及NK细胞的含量之间相关性分析

　　对NSCLC患者外周血中CD11c+、CD123+百

　　在FSC vs SSC散点图中划出单个核细胞区R1，然后将Lin1表达阴性细胞设为R2(排除T、B、NK等细胞)，再将HLA-DR+CD11c+或HLA-DR+CD123+设为R3(MDC或PDC)

　　在FSC vs SSC散点图中划出淋巴细胞区R1，其中CD3-/CD16+CD56+者即为NK细胞

　　分数与IL12、NK细胞的含量进行相关性分析。结果显示，NSCLC 患者血浆IL12 浓度同CD11c+百分数呈正相关(P<0.05);NK细胞的含量与CD11c+百分数呈正相关(P<0.05)，而与CD123+百分数呈负相关(P<0.01)。而NSCLC 患者血浆IL12 浓度同NK细胞的含量之间亦有关联性，即两者呈正相关(P<0.01)。 肺癌患者与健康对照组外周血中 NK细胞含量及T细胞亚群的检测结果 40例肺癌患者树突状细胞亚型与外周血IL12、NK细胞含量之间的相关性 40例肺癌患者树突状细胞亚型与临床病理特征的关系

　　2.4 肺癌患者树突状细胞亚型、NK细胞含量与临床病理特征分析的关系

　　肺癌患者树突状细胞亚型、NK细胞含量与临床病理特征的关系。按照卡氏评分(<80vs≥80)、化疗史(有vs无)分组，CD11c+DC百分数有极其显著性差异(P<0.01)，CD123+DC百分数有显著性差异(P<0.05);按照病理类型(腺癌vs鳞癌)分组CD11c+DC百分数差异有统计学意义(P<0.05);其余分组(性别、年龄、临床分期)之间的各DC亚型百分数比较差异均无统计学意义。而NK细胞的含量仅与年龄相关(P<0.05)，同其他临床特征无明显关联(P>0.05)。

　　3 讨论

　　3.1 肺癌患者DC亚型的特征

　　树突状细胞(DC)是一种专职的抗原提呈细胞， 依据 DC起源和功能，将人外周血 DC 分为两个亚群：DC1亚群为髓样细胞来源(myeloid DC)，它以 CD11c+DC 前体形式存在于外周血中，在炎症刺激时分化为成熟的 CD11c+ DC， 产生白细胞介素IL12， 促进 Th1 应答; DC2亚群为淋巴样细胞来源(lymphoid DC)， 由其 CD123+DC 前体细胞加 IL3 诱导后分化为成熟的淋巴样 DC，不产生 IL12，诱导 Th2 应答。新鲜分离的外周血 DC 缺乏树枝状的形态学特征，其表面均弱表达或不表达单核细胞、淋巴细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞及天然杀伤细胞的标记抗原， 但高表达HLADR 抗原。因此，将 淋 巴 细 胞 系 列 抗 原 (Lin1：CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56的混合体) 表达阴性或弱阳性，HLADR表达阳性来初步界定DC群， 再根据 CD11c 和 CD123的表达来确定分别为 CD11c+DC/DC1和 CD123+ DC/DC2。

　　本次的实验结果表明：肺癌患者外周血CD11c+DC/DC1在白细胞中所占比例低于正常人(P=0.000)，而CD123+ DC/DC2在白细胞中所占比例与正常人无显著差异(P=0.829)，且CD11c+DC/DC1在数量上比CD123+ DC/DC2占优势，说明肺癌患者DC递呈抗原水平低于正常人，提示肺癌患者机体免疫功能受损，难以促使未成熟DC向MDC分化，不能有效地通过细胞免疫途径杀伤体内的肺癌细胞;而LDC无明显增多，即Th2型反应无明显增强，说明体内针对肺癌细胞的体液免疫应答无明显增强。

　　3.2 肺癌患者DC亚型与NK细胞的关系

　　树突状细胞(DC)和自然杀伤(NK)细胞是自身免疫系统的两种独特成分，在免疫调节和适应性免疫反应的建立过程中起关键性作用。NK细胞主要通过细胞毒性效应以及产生细胞因子起作用，而DC则识别病原体并向适应性免疫系统发出警报。NK细胞是自体免疫系统中主要的淋巴细胞，通过其细胞因子产物溶解细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用，具有体外杀伤肿瘤细胞的功能。

　　研究表明，DCNK细胞相互作用可导致细胞激活、成熟甚至死亡。Fernandez等[8]的早期研究通过证明DC激活NK细胞抗肿瘤活性，首先证实了体内DCNK细胞的相互作用。体外研究表明，NK细胞和成熟DC的接触导致两种细胞的激活和细胞因子的产生，包括NK细胞增殖和DC成熟[911]。DC可以通过各种机制提高NK细胞的生存率，增加NK细胞活性和分化。其中重要的机制之一就是DC分泌的细胞因子，如IL12。IL12曾一度被称为自然杀伤细胞刺激因子或细胞毒性淋巴细胞分化因子，人体内的DC1可通过分泌IL12，促进Thl反应，诱导细胞免疫，而IL12又可促进DC1的分化、成熟。事实上，人体内的DC能更好地支持NK细胞的存活[12]。成熟的DC还是IL12的主要来源，IL12可以增加NK细胞介导的细胞毒性和IFNγ产生[13]。

　　本研究结果显示NSCLC患者外周血MDC含量及血浆IL12降低，说明NSCLC状态下外周血MDC存在IL12分泌能力的障碍，从而影响了NK细胞的活性。提示NSCLC患者体内不仅存在MDC数量的减少，而且存在NK细胞功能上的缺陷。NSCLC患者体内DC产生和功能上的缺陷是肿瘤细胞逃脱机体监视的重要机制之一。另外，检测结果显示，随着CD123+ DC/DC2的百分含量下降，肺癌患者NK细胞含量增高(P=0.018)，两者呈显著负相关。本试验证实，DCNK之间的相互作用和通讯，构成了一个正反馈环路，一旦2种细胞中的任何一种细胞感受到了“危险”或组织损伤发生，这一环路将被激活。DCNK细胞之间的相互作用是接触依赖型的，但也同时包括细胞因子之间的交互作用。

　　3.3 DC亚型与NK细胞之间关系分析的临床意义

　　由此可见，DC亚型分布情况、NK细胞含量在判断非小细胞肺癌患者病情发展上有一定的临床意义，它们同卡氏评分、是否化疗等临床特征之间均有十分密切的关系。所以，当肺癌发生时，宿主的DC亚群及NK细胞的功能低下、比例失调，导致机体免疫平衡失调。

　　随着肿瘤患者病情的发展，肿瘤某些生物学特征(机体免疫状态和其他一些生物学指标等)同时发生一些变化，进而提示这些指标之间有一定的相关性。本组研究表明，晚期非小细胞肺癌患者在接受化疗过程中，随着卡氏评分的逐渐降低，机体免疫功能逐渐下降，与此同时，DC各亚型的百分比也明显下降;提示肺癌患者外周血DC亚型与机体免疫状态之间有一种间接的相关性。

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