影响胶质瘤复发时间的多因素分析

　　作者：张明杰,刁宏宇,王成林　　作者单位：中国医科大学附属盛京医院 神经外科,辽宁 沈阳 110004

　　【摘要】目的 探讨患者年龄、性别、手术切除程度、肿瘤大小、KPS评分、术后放/化疗、病理分级、肿瘤增殖性和侵袭性对胶质瘤复发时间的影响。方法 应用免疫组化方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶9(MMP9)在复发胶质瘤中的表达情况，结合临床资料进行分析。 结果 (1)PCNA、MMP9的表达在胶质瘤复发后有增加趋势，并同病理分级呈正相关;(2)患者年龄、肿瘤大小、KPS评分、病理分级、手术切除程度、术后放/化疗、PCNA表达水平是胶质瘤复发时间的影响因素;(3)多因素分析中，组织学分级、手术切除程度、KPS和术后放/化疗是影响胶质瘤复发时间的独立因素。结论 组织学分级是影响胶质瘤复发时间长短的主要危险因素，术前KPS评分较高者有利于长期生存，手术全切与术后放/化疗可以明显延长再次手术的时间间隔;相对于肿瘤侵袭能力而言，增殖能力与胶质瘤复发的关系更为密切。

　　【关键词】 胶质瘤 复发时间 增殖细胞核抗原 基质金属蛋白酶 9 多因素分析

　　Multi factor analysis on the time of gliomas recurrence

　　ZHANG Mingjie, DIAO Hongyu，WANG Chenglin

　　(Department of Neurosurgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shen Yang,110004 China)

　　Abstract：Objective To investigate the effects of patient age, gender, extent of surgery, tumor size, Karnofsky performance status(KPS) score, radiotherapy or chemotherapy, pathologic grade, proliferation and invasion on the time of gliomas recurrence. Methods The expressions of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) and matrix metalloproteinases9(MMP9) in human primary and recurring gliomas were detected by immunohistochemistry, and these results were analyzed with clinical data on the time of gliomas recurrence. Results (1)Expressions of PCNA and MMP9 showed a tendency to increase after recurrence, and they were also positively correlated with pathologic grading; (2)Patient age, extent of surgery, tumor size, KPS score, radiotherapy or chemotherapy, histological grade, proliferation exerted effects on the time of gliomas recurrence. (3)The result of multivariate COX analysis showed that the pathologic grade, extent of surgery, KPS score and radiotherapy or chemotherapy were significantly correlated with the time of gliomas recurrence. Conclusion Histological grade is the major risk factor of the time of gliomas recurrence. Higher KPS scores facilitated long term survival. Entire operation and radiotherapy or chemotherapy can extend the interval time prior to reoparation. Proliferation has a closer relationship with gliomas recurrence than invasion.

　　Key words：gliomas; time of recurrence; proliferating cell nuclear antigen; matrix metalloproteinases9; multiple factor analysis

　　胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，手术难以做到彻底切除，常在短期内复发，而且术后复发的时间间隔越短，患者的预后也就越差，因而如何才能延缓胶质瘤术后的复发成为临床医生所关注的焦点。本研究选取反映肿瘤细胞增殖性指标增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)与侵袭性指标基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)，应用免疫组织化学染色技术检测其在胶质瘤复发前后的表达情况，并结合相关临床因素探讨影响胶质瘤复发时间的因素。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集本院在2000年—2005年间手术切除同一患者原发、复发胶质瘤标本，每位患者均取2次术后石蜡病理组织块，共计48块。另外取因重度颅脑损伤而行内减压手术切除的脑组织，制成石蜡标本作为非肿瘤对照组，计10例。

　　1.2 一般资料

　　本组共24例，其中男13例，女11例;胶质瘤复发时间最短1个月，最长34个月，平均12.96个月。病理分级：原发组Ⅰ级6例、Ⅱ级7例、Ⅲ级6例、Ⅳ级5例;复发组Ⅰ级2例、Ⅱ级3例、Ⅲ级8例、Ⅳ级11例。临床资料中选取年龄、性别、原发肿瘤大小、病理分级、首次手术切除程度、术前KPS(Karnofsky performance status)评分、术后放/化疗作为评估参数。

　　1.3 免疫组织化学染色方法

　　主要试剂：鼠抗人PCNA单克隆抗体、鼠抗人MMP9单克隆抗体、鼠超敏SP试剂盒(即用型)和 DAB显色试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司。采用链菌素亲生物素过氧化物酶法(SP法)进行免疫组织化学染色，以乳腺癌标本染色作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗染色作为阴性对照。

　　1.4 结果判定

　　PCNA在正常组织和个别低级别肿瘤中不表达，阳性染色主要位于增殖细胞细胞核，少数位于细胞浆，染色特点为细胞核呈棕黄色着色(图1a、b);MMP9一般在正常脑组织不显色，在胶质瘤中主要位于侵袭边缘瘤细胞和血管基底膜上及内皮细胞胞浆，呈棕褐色异质染色者为阳性(图1c、d)。随机选取5个视野，然后在高倍视野(×400)下计数染色阳性的细胞核数，取其均值并计算出染色阳性细胞的百分率，阳性率≤25%为“+”;26%～50%为“++”;51%～75%为“+++”;>75%为“++++”。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS 10.0统计软件对所获数据进行分析。相关性的比较采用Spearman等级相关分析，PCNA、MMP9的表达情况与各临床因素同胶质瘤复发时间的分析采用COX单因素分析，并选择其中有意义的变量进一步行多因素分析。

　　a、b. PCNA在Ⅱ、Ⅳ级胶质瘤中的表达　c、d. MMP9在Ⅱ、Ⅳ级胶质瘤中的表达

　　　2 结果

　　2.1 PCNA与MMP9在肿瘤复发前后的表达情况

　　在各病理级别标本中的表达情况见表2。对比PCNA与MMP9在胶质瘤复发前后的表达强度，显示出胶质瘤的增殖性与侵袭型在复发后均有增强趋势。Spearman等级相关分析的结果显示，PCNA与病理分级存在较好的相关性，同时MMP9虽然也与病理级别正相关，但二者之间并无统计学关联(r=0.247，P=0.090)。

　　采用配对资料的符号秩和检验比较复发前后的表达强度，*P=0.006;** P=0.02

　　Spearman等级相关分析比较表达程度与病理分级的相关性，*r=0.741，P=0.000;**r=0.314，P=0.030

　　2.2 影响胶质瘤复发时间的单因素分析

　　采用COX回归模型，在P=0.05水平上对选取的变量逐一进行分析，患者年龄、肿瘤大小、手术切除程度、病理学分级、KPS评分、术后放/化疗、PCNA表达程度对影响胶质瘤的复发时间具有统计学意义，其中，病理学分级对胶质瘤复发时间影响最大。

　　2.3 影响胶质瘤复发时间的多因素分析

　　选择单因素分析中有意义的变量行COX多因素回归分析，在P=0.05水平上，对胶质瘤复发时间有影响意义的变量有病理学分级、手术切除程度、术前KPS评分、术后放/化疗4个。其中，病理学分级对于胶质瘤复发时间影响最大。

　　3 讨论

　　胶质瘤的复发是临床上普遍存在的现象，尤其是恶性度较高的胶质瘤，即便是采取手术切除与放、化疗结合的综合治疗方法，仍难以避免复发。回顾性研究显示，胶质瘤多在术后1年内复发，80%的复发肿瘤局限在原发灶周围2 cm以内，但仍有少数位于此范围之外甚至出现于对侧[1]，而且复发后的胶质瘤恶性度往往增加[2]，会变得更具侵袭性。多数学者认为，胶质瘤复发的根本原因在于肿瘤细胞的残留，而复发时间的长短主要与患者所患肿瘤的生物学特性及采取的治疗有关。

　　临床上对于初次发现的胶质瘤患者，只要状态允许，大多采取手术切除。病理级别高的胶质瘤，其生长迅速、侵袭范围广，手术切除程度有限;而病理级别低的肿瘤增殖速度较慢、侵袭范围有限，手术容易达到较高的切除程度。但由于胶质瘤具有浸润性生长的特点，在肿瘤周围水肿带内、MRI增强区域以外尚有肿瘤细胞的存在，而术者在切除程度的判断上又缺乏客观依据，因此对胶质瘤切除程度与患者预后的影响尚存有争议。但多数学者仍认为手术是目前胶质瘤治疗的首选，尽可能全切肿瘤可以延缓肿瘤生长、延长再次手术的时间间隔。同时近年来有学者采用肿瘤光动力方法来区分胶质瘤与正常组织的界限[34]，力争达到真正意义上的全切，这为今后的胶质瘤手术治疗提供了新的方向。

　　胶质瘤术后辅以放、化疗可以延缓肿瘤的复发，延长患者生存期，但是放、化疗自身存在一定缺陷：放射区域或射线量的选择不当可能会诱导肿瘤细胞发生病理生理学变化甚至发生放射性脑病，射线量不足又无法达到治疗作用;采用卡氮芥和PCV方案治疗可以明显延缓胶质瘤的生长[5]，但化疗药物的骨髓抑制又不容忽视，而且化疗方案因人而异，由于肿瘤的耐药性或药物使用不当诱导肿瘤细胞分泌抗原抗体、抑制免疫系统又可导致复发。

　　美国肿瘤放射治疗协作组的研究认为胶质瘤术前KPS评分与患者的生存预后相关。本研究中KPS为影响胶质瘤复发时间的独立因素，究其原因在于KPS高者肿瘤尚处于早期阶段或为进展缓慢的低度恶性肿瘤，对神经系统的破坏较小，而且患者对于治疗的耐受性也较好，因而KPS高者有利于患者预后。

　　有研究表明胶质瘤体积对患者5年生存率的影响具有显著性差异[6]。本研究中肿瘤体积也是影响胶质瘤复发时间的因素之一。一般肿瘤体积小反映肿瘤尚处于早期阶段或为低度恶性而进展缓慢，考虑到它与病理分级的相关性(r=0.41)，因此在多因素分析中失去其独立影响作用。美国脑肿瘤研究协作组的一项研究发现，星形细胞瘤的平均年龄较胶质母细胞瘤年龄小10岁。本研究中，年龄较小者胶质瘤复发时间也相对较长，这与年轻患者所患胶质瘤病理级别较低、对治疗的依从性较好有关。

　　在肿瘤发生过程中，其细胞核内多肽类物质的产生要早于核形态的改变，仅根据细胞学形态和核分裂难以准确判断肿瘤的生物学行为，因此有学者提出在进行病理分级的同时，从分子生物学水平评估其分化状态。人类PCNA基因位于第20号染色体，作为DNA多聚酶δ的辅助蛋白，在DNA复制合成过程和修复过程中发挥重要作用，其量的变化与DNA合成一致。大多数学者认为PCNA反映了肿瘤细胞的增殖能力，与肿瘤恶性程度密切相关[78]，可以预测胶质瘤术后复发的危险性，并同患者预后相关。MMP9作为基质金属蛋白酶家族中的一员，在肿瘤对正常组织的侵袭过程中发挥着重要作用，而且还是血管发生启动系统中的成员[9]，有研究表明MMP9同胶质瘤的侵袭程度、水肿带范围、肿瘤血管生成密切相关，其表达强度与胶质瘤恶性程度密切相关[10]。

　　在本研究中，PCNA、MMP9的表达强度在肿瘤复发后有增强趋势，并且均同病理级别正相关，但PCNA、MMP9二者之间不存在相关性。这说明肿瘤的恶性度并非单指病理学分级而言，增殖性、侵袭性与组织学上的多形性在不同方面反映了肿瘤的生物学行为，细胞高增殖率仅是恶性度的标志之一，胶质瘤细胞在增殖和侵袭迁移之间的关系是相当复杂的，存在着不同的发生机制。在单因素分析中，PCNA表达对胶质瘤复发时间的影响具有统计学意义，但在多因素分析时失去其独立影响作用。考虑到PCNA同病理分级具有良好的相关性(r=0.741)，提示肿瘤增殖性对胶质瘤复发的影响作用可能不是直接的，而是通过组织学分化进而起到间接的影响作用。

　　综上所述，PCNA作为反映肿瘤细胞增殖性的指标，在一定程度上反映了术后复发的危险性，但胶质瘤能否在短期内复发主要取决于组织学分化程度，KPS是一项较好的评估患者预后的指标，同时手术全切和术后放/化疗可以延缓胶质瘤的复发。

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