白藜芦醇对淋巴瘤细胞增殖及细胞因子分泌的影响

　　作者：马泳泳　　作者单位：温州医学院附属第一医院 温州

　　【摘要】 [目的]探讨白藜芦醇(resveratrol，Res)对淋巴瘤Raji细胞增殖及细胞因子白介素8(IL8)和血管内皮细胞生成因子(VEGF)基因表达和分泌的影响。[方法]用不同浓度白藜芦醇处理Raji细胞48h后，用MTT法检测细胞增殖指数，用ELISA法检测IL8和VEGF蛋白含量，用逆转录/聚合酶链反应(RT/PCR)检测IL8和VEGF mRNA表达情况。[结果]白藜芦醇体外对Raji细胞无增殖抑制作用，不同浓度白藜芦醇作用Raji细胞48h后，白藜芦醇1组、2组和3组IL8、细胞上清液VEGF蛋白含量，均显著低于对照组(P<0.05);IL8、VEGF mRNA表达相对强度，均显著低于对照组(P<0.05)，且随浓度增加而减弱。[结论]白藜芦醇体外对Raji细胞无增殖抑制作用，但可抑制IL8 和VEGF的分泌及mRNA的表达，这可能是白藜芦醇抗肿瘤血管生成的重要机制。

　　【关键词】 淋巴瘤;白藜芦醇;细胞增殖;细胞因子

　　The Effects of Res on Expression and Secretion of IL8 and VEGF of Lymphoma Raji Cells Ma Yongyong Department of Hemotology，The First Affliated Hospital of Wenzhou Medical College (325027)，China

　　Abstract：[Objective] We aimed to investigate the effects of angiogenic inhibitor vitro.[Method] We examined the serum contents of IL8 and VEGF in supernatant，by specific ELISAs of Raji cells after treatment by Res of different dosage(25μmol/l～100μmol/l).The expression of IL8 and VEGF mRNA was detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR).[Results] The protein contents of IL8 in supernatant of Res(25μmol/l～100μmol/l) were(532.3±54.6)pg/ml，(487.3±63.0) pg/ml and (380.9±47.9) pg/ml respectively，significantly lower than that in the control.The protein contents of VEGF in supernatant of Res(25μmol/l～100μmol/l) were (73.3±10.9) pg/ml，(46.6±19.8) pg/ml，(30.2±12.8) pg/ml respectively，significantly lower than that in the control.The relative values of expression of IL8 mRNA in treated groups (25μmol/l～100μmol/l) were (0.21±0.06 )，(0.17±0.09) and (0.12±0.07) respectively.The values of expression of IL8 mRNA were significantly lower than control group.And the values were in inverse correlation with concentration.The relative values of expression of VEGF mRNA in treated groups were (0.46±0.21)，( 0.21±0.13) and ( 0.09±0.08) respectively.The values of expression of VEGF mRNA were significantly lower than control group and were in negative correlation with concentration.[Conclusions] These findings suggest that Res may inhibt the expression and secretion of IL8 and VEGF，which may be one of the most important mechanisms.

　　Key words：lymphoma;Res;IL8;VEGF

　　近年来，恶性淋巴瘤的治疗虽有很大进展，中、高度恶性NHL的治愈率已达到40 %，而其余60 %难治和复发性NHL患者仍是影响淋巴瘤患者长期生存的难题，它们对二线化疗药物的反应差异显著。但目前关于白藜芦醇的淋巴瘤治疗方面的的研究甚少。在本实验中我们通过观察白藜芦醇体外对淋巴瘤细胞增殖及血管生成相关因子IL8和VEGF的表达和分泌，来初步探讨白藜芦醇对淋巴瘤的作用效果。

　　1 实验材料

　　人类淋巴瘤细胞株Raji(中国科学院上海生科院细胞资源中心);白藜芦醇(Sigma公司) 纯度>99.9%，用二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)溶解;RPMI1640细胞培养液(Life Technologies，NY);胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清(杭州四季青公司);IL8、VEGF和βactin引物序列由北京奥科生物技术公司合成;RTPCR试剂盒，IL8、VEGF ELISA试剂盒购自晶美生物工程公司。

　　2 实验方法

　　2.1 细胞培养 淋巴瘤细胞株Raji细胞使用含10%胎牛血清、2mmol/L L谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素的RPMI1640的培养基，细胞置于37℃、100%相对湿度和含5%CO2空气的细胞培养箱中培养。

　　2.2 分组 实验分为对照组，白藜芦醇1组(25μmol/L)，白藜芦醇2组(50μmol/L)，白藜芦醇3组(100μmol/L)4组。

　　2.3 细胞增殖指数的测定 调整细胞浓度为1×105/ml，重新接种到96孔培养板，约1×104/孔，37℃过夜，然后，将细胞分白藜芦醇处理组、溶剂对照组及空白对照组：白藜芦醇组分别换用含不同浓度白藜芦醇(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)的培养液100μl;溶剂对照组换用100μl含与白藜芦醇相应浓度DMSO的培养液;含100μl培养液(不含细胞与药物)孔板作为空白对照组。每组设3复孔。分别培养48h后，加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，继续培养4h后，去上清，加入DMSO100μl/孔，室温振荡10min，上酶标免疫测定仪检测，492nm波长测定吸光度值(absorbance，A)。比色时，空白组调零。计算细胞增殖抑制率，抑制率=(1处理组A/溶剂对照组A)×100%。绘制不同时间浓度抑制率曲线。以上实验重复3次。

　　2.4 IL8、VEGF的上清液浓度的测定 Raji细胞接种于培养瓶中培育，24h后收集经培养液制成细胞悬液，加入96孔培养板(每孔细胞数为2×104个)中培养24h后，分为对照组、白藜芦醇1(25μmol/L)组，白藜芦醇2(50μmol/L)组和白藜芦醇3(100μmol/L)组，每组设3复孔，各组培养48h后，留取培养上清液用IL8和VEGF，ELISA试剂盒测定上清中IL8和VEGF浓度。

　　2.5 IL8 mRNA和VEGF mRNA表达水平 细胞经对照组、白藜芦醇1(25μmol/l)组、白藜芦醇2(50μmol/l)组和白藜芦醇3组(100μmol/l)分别作用48h后收集Raji细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA。取5μgRNA逆转录合成cDNA链。取2μL cDNA作为模板，加入IL8 mRNA和VEGFmRNA引物，IL8(5’cagaaggtggatagacaa3’，5’caaggttgggtggtagtc3’)扩增引物长度280bp，VEGF(5’atgaactttctgctgtcttg3’，5’tgcat ggtgatgt tggac3’)，扩增引物长度382 bp。经过95℃变性5min后进入循环，包括95℃变性45s，54℃退火90s，72℃延伸90s，30个循环。βactin(5’tgggcatgggtcagaaggat3’;5’aagcatttgcggtggacgat3’，991bp)作为内参照。取10ul扩增产物用1.7%的琼脂糖凝胶电泳，自动凝胶成像系统拍照。对目的电泳条带进行A峰值下面积积分，以(IL8/βactin)×100%和(VEGF/βactin)×100%作为IL8 mRNA和VEGF mRNA的相对表达水平，并比较其变化。以上实验重复3次。

　　2.6 统计学方法 所有计算数据采用x±s来表示，组间的多重比较采用方差分析和LSDt检验，并采用SPSS 10.0软件分析处理，P<0.05为差异具有显著性。

　　3 结果

　　3.1 增殖抑制率 Raji淋巴瘤细胞与各组药物共培养48h后行MTT检测，结果显示：与对照组比较，白藜芦醇对Raji淋巴瘤细胞无增殖抑制作用，见表1。表1 体外细胞培养生长抑制率测定结果

　　3.2 培养上清液IL8、VEGF浓度 白藜芦醇处理Raji细胞48h后，白藜芦醇1组、2组和3组细胞上清液IL8浓度分别为(532.3±54.6)pg/ml，(487.3±63.0 ) pg/ml，(380.9±47.9) pg/ml，显著低于对照组的(892.3±97.6) (P<0.05)。白藜芦醇处理Raji细胞48h后，白藜芦醇 1～3组细胞培养上清液VEGF浓度分别为(73.3±10.9) pg/ml，(46.6±19.8) pg/ml，(30.2±12.8) pg/ml，显著低于对照组的(99.4±10.2)pg/ml (P<0.05)。结果分析示：处理组细胞IL8和VEGF培养上清液浓度均显著低于对照组(P<0.05)，且在一定范围内呈浓度依赖性。

　　3.3 IL8 mRNA 和VEGF mRNA表达水平 以DNAladder Marker为标志，分别在280bp、382bp和991bp处可见扩增条带，电流带的位置与IL8、VEGF和βactin的理论值相符。IL8 mRNA 表达水平随着白藜芦醇作用浓度加大而减弱，相对mRNA转录水平对照组为(1.07±0.31)，白藜芦醇1组为(0.21±0.06)，2组为(0.17±0.09)， 3组为(0.12±0.07 )。各处理组表达强度均显著低于对照组(P<0.05)，且随浓度增加而减弱。VEGF、mRNA 表达水平也随着白藜芦醇作用浓度增加而减弱。相对mRNA转录水平对照组为(1.03±0.19)，白藜芦醇1组为(0.46±0.21)， 2组为(0.21±0.13)， 3组为(0.09±0.08 )。各处理组mRNA表达强度均显著低于对照组(P<0.05)，且随浓度增加而减弱。

　　4 讨论

　　NHL目前最主要的治疗方法仍为化疗，其余尚有局部放疗、生物及免疫治疗等。通过以上手段，可使部分患者病情缓解，但仍有相当一部分患者属于难治、复发范畴。1995 年，Vacca 等[1]对B细胞非霍奇金淋巴瘤患者的研究表明，淋巴瘤的恶度程度越高，患者淋巴结新生血管数目越多，内皮下基底膜层连蛋白和Ⅵ型胶原成分均较强表达。故抗血管新生治疗成为恶性淋巴瘤一种新的治疗手段。

　　白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种多酚类化合物，化学名为芪三酚(3，5，4'trihydroxystibene)，已在虎杖、葡萄等72种植物(隶属12个科，32个属)中被发现。研究已经表明，白藜芦醇具有抗病毒及抗肿瘤作用[23]，并且能诱导内皮细胞凋亡[4]，表明白藜芦醇可能通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管生成而发挥抗肿瘤作用。但白藜芦醇的抗肿瘤作用因肿瘤细胞而存在差异。

　　IL8属于趋化因子CXC基因家族，是一种多功能的细胞因子，它在淋巴瘤有高表达[5]。 IL8以旁分泌方式与白细胞和血管内皮细胞表面的CXCR受体结合，促使白细胞趋化进入肿瘤组织和引起内皮细胞增殖形成新生血管，从而加速肿瘤生长和转移[6]。VEGF是作用最强的促血管生长因子，能特异性刺激血管内皮细胞增殖与血管生成，肿瘤表达增高，可促进新生血管生成，与微血管密度、肿瘤恶性程度呈正相关。VEGF 还可诱导内皮细胞增殖和抑制细胞凋亡，在体内可诱导血管生成和增加血管的通透性，是血管形成过程中起核心作用的因子[7]。本实验为白藜芦醇的作用机理进行了进一步的研究，白藜芦醇对RAJI淋巴瘤细胞无增殖抑制作用，发现白藜芦醇体外通过抑制IL8 和mRNA表达和分泌，表明 白藜芦醇可能通过抑制IL8而抑制内皮细胞增殖形成新生血管，从而抑制肿瘤生长和转移，为白藜芦醇的临床应用提供了理论基础。

　　【参考文献】

　　[1] Rubatti D，Vacca A，Nico B，et al.Angiogenesis spect rum in the st roma of B2cell non2Hodgkin ’ s lymphomas.Animmunohistochemical and ult rast ructural study [J].Eur J Haematol，1996，56 (122)：45253.

　　[2] PozoGuisado E，Merino JM，MuleroNavarro S，et al.Resveratrolinduced apoptosis in MCF7 human breast cancer cells involves a caspaseindependent mechanism with downregulation of Bcl2 and NFkappaB[J].Int J Cancer，2005，115(1)：7484

　　[3] 王志洁，黄岐善.白藜芦醇与黄芪总皂甙合用抗Ⅱ型人疱疹病毒药效分析[J].浙江中医学院学报，2005，29(6)：8084.

　　[4] Cao Y，Fu ZD，Wang F，et al.Antiangiogenic activity of resveratrol，a natural compound from medicinal plants[J].J Asian Nat Prod Res.，2005，7：205213.

　　[5] Miyamoto M，Shimizu Y，Okada K，et al.Effect of interleukin8 on production of tumorassociated substances and autocrine growth of human liver and pancreatic cancer cells[J].Cancer Immunol Immunother，1998，47：4757.

　　[6] Ferrer FA，Pantschenko AG，Miller LJ，et al.Angiogenesis and neuroblastomas：interleukin8 and interleukin8 receptor expression in human neuroblastoma[J].J Urol，2000，164：10161020.

　　[7] An FQ，Matsuda M，Fujii H，et al.Expression of vascular endothelial growth factor in surgical specimens of hepatocellular carcinoma[J].J Cancer Res Clin Oncol，2000，126：153160.