凋亡基因Caspase3在乳腺癌中的表达及其临床意义

　　作者：黄凌燕,张建中,曲娜　　作者单位：宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川 750004

　　【摘要】 目的 探讨乳腺癌进展中Caspase3基因表达的临床意义。方法 用免疫组织化学和Western Blot技术检测21例乳腺腺病、21例乳腺纤维腺瘤、96例原发性乳腺癌病灶中Caspase3蛋白表达情况。 结果 乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌中Caspase3蛋白表达阳性率分别为85.72%(18/21)、61.90%(13/21)、23.96%(23/96)，乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率明显低于乳腺良性病变(P=0.000)。乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率越低，淋巴结转移个数越多，临床分期越高(P=0.010)。结论 Caspase3对判断乳腺良恶性疾病及乳腺癌的发展程度具有参考价值。

　　【关键词】 乳腺癌;Caspase3;免疫组化;Western Blot

　　Expression of Caspase3 and its clinical significance in breast cancer　HUANG Ling-yan, et al.　(The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)　[Abstract] Objective To investigate the expression of cyserinly aspartate-specific protease 3 (Caspase3), and to reveal the correlation between their expression and clinical-pahtology parameters of breast cancer and to analyze the effect on the pathogenesis and progression of breast cancer.Methods The data of clinic and pathology of 21 cases with adenosis of breast, 21 cases of fibroadenoma of breast, and 96 cases of breast caner was respectively collected. All specimens were evaluated by histopathology, immunohistochemistry technique and Western Blot technique with antibodies against of caspase3. The correlation of these factors was analyzed.Results The positive rate of caspase3 protein expression in adenosis, fibroadenoma and carcinoma of breast was 85.72% (18/21), 61.90% (13/21) and 23.96% (23/96), respectively. The positive rate of caspase3 protein expression of breast cancer was statistically lower than benign lesions of breast (P=0.000). The decreased caspase3 protein expression of breast cancer associated significantly with more lymph node metastases and higher clinical stage (P=0.010). Conclusion Caspase3 expression in breast cancer is significantly lower than benign lesions of breast. It has an important value on differentiation between the benign and malignant lesions of breast.

　　[Key words] Breast cancer; Cyserinly aspartate-specific protease3; Immunohistochemistry; Western blot

　　研究表明，细胞凋亡受阻或增殖失控参与肿瘤的形成。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cyserinly aspartate-specific protease， Caspase3)在细胞凋亡的执行期发挥关键作用，并与凋亡的形态学特征密切相关[1]。Caspase3与乳腺癌的发生有一定关系，本文就Caspase3在乳腺良恶性疾病中的蛋白表达情况及其对于乳腺癌的发展、预后方面的影响做一探讨。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料：选取宁夏医科大学附属医院2001年8月-2005年4月术前均未进行过放化疗的乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌患者138例做为研究对象。患者全部为女性，21例乳腺腺病患者年龄最小24岁，最大74岁，中位年龄47岁。21例乳腺纤维腺瘤患者年龄最小25岁，最大53岁，中位年龄38岁。肿瘤最大直径5cm，最小1.5cm，平均值2.59cm。96例乳腺癌患者年龄最小28岁，最大80岁，中位年龄48岁。癌灶最大直径10cm，最小0.3cm，平均3.37cm。其中导管原位癌12例，浸润性导管癌73例。49例无淋巴结转移，47例有淋巴结转移。

　　1.2 方法：

　　1.2.1 免疫组化技术:单克隆鼠抗人IgG抗体Caspase3(克隆号：3CSP01，NeoMarker Fremont公司)，S-P免疫组织化学染色试剂盒采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原，包括A剂和B剂，购自福州迈新生物技术公司。所有标本均经10%福尔马林固定，常规取材石蜡包埋，切片厚5μm，行HE染色，光镜观察。使用SP二步法免疫组化检测试剂盒，按产品使用说明书进行操作，以迈新生物技术公司赠送的教学切片为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，3，3'-二氨基联苯胺(DAB)显色。

　　Caspase3蛋白表达于细胞浆，染色结果分为4个级别：阴性(-)，无阳性细胞或阳性细胞数<5%;弱阳性(+)，阳性细胞数5%-25%;中度阳性(++)，阳性细胞数26%-50%;强阳性(+++)，阳性细胞数>50%。

　　1.2.2 凝胶电泳和Western blot:多克隆鼠抗人IgG抗体Caspase3(NeoMarker Fremont公司)及硝酸纤维膜(Amersham Biosciences公司)用于Western blot试验。收集乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺原位癌、乳腺浸润性癌新鲜病灶组织各12例，加入组织裂解液冰上裂解组织，提取总蛋白。每份标本提取总蛋白50μg经12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后将电泳产物转移至硝酸纤维膜上，加入5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入一抗及二抗，5-氯-1-萘酚显色。应用Bio-Rad Co.生物医学图象分析系统对硝酸纤维素膜上的目的条带进行扫描和密度分析。

　　1.3 统计学处理: 采用SPSS 11.5 统计软件进行数据统计，主要方法为卡方检验和Kaplan-Meier生存分析。P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Caspase3免疫组化检测结果：Caspase3蛋白表达在乳腺腺病中阳性率最高，阳性着色强度主要以强阳性为主，弥漫分布，在乳腺癌中阳性率最低，阳性着色强度主要以弱阳性为主，灶性或散在分布，乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率显著性低于乳腺良性病变(χ2=32.983，P=0.000)。

　　乳腺癌Caspase3蛋白表达与患者年龄(χ2=0.036，P=0.849)、癌灶大小(χ2=0.573，P=0.449)之间均无统计学意义。

　　按淋巴结转移个数分组，无腋窝淋巴结转移、淋巴结1-3个和>3个时，乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率分别为34.69%(17/49)、21.43%(6/28)、0%(0/19)，腋窝淋巴结转移超过3个的病例全部为阴性;相关分析可见，乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率越低，淋巴结转移个数越多(χ2=9.184，P=0.010)。临床1、2、3期乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率分别为34.69%(17/49)、13.64%(6/44)、0%(0/3)，Caspase3蛋白表达越低，临床分期越高(χ2=8.736，P=0.010。

　　96例乳腺癌患者，有术后5年随访资料的47例，其中死亡12例，35例存活。平均生存期为48.88个月，标准误为2.31，95%的可信区间为44.35-53.42。应用Kaplan-Meier分析乳腺癌Caspase3蛋白表达与生存率的关系，从的生存曲线可见，乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性者的生存曲线始终位于阴性者的上方，提示乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性患者生存率比阴性患者生存率有增高的趋势。

　　2.2 Caspase3 Western blot检测结果：Western blot检测发现，在相对分子量32kD附近可见Caspase3蛋白杂交条带。应用生物医学图象分析系统，对硝酸纤维素膜上的目的条带进行扫描和密度分析可见，乳腺腺病及乳腺纤维腺瘤的平均OD值分别为0.479、0.328，乳腺癌组织中Caspase3明显减少。

　　3 讨论

　　体外研究表明[2],将pcDNA3-revCaspase-3重组质粒直接注射乳腺癌细胞系SKBr-3细胞,能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。动物实验[3]用重组PCR的方法获得大、小亚基顺序颠倒的重构型Caspase-3基因并将其克隆人真核表达载体pcDNA3直接注射荷瘤裸鼠，结果显示转染组较同期对照组出现明显的细胞死亡现象，pcDNA3-revcasp-3重组质粒直接注人对荷瘤裸鼠肿瘤生长有明显抑制作用，提示Caspase3含量减少与乳腺癌的发生有关。本研究中Caspase3在乳腺癌中的蛋白表达显著性低于乳腺良性疾病，且与乳腺癌临床分期及淋巴结转移个数呈显著性负相关，说明Caspase3含量的降低与乳腺癌细胞凋亡减少相关，其在乳腺癌的发生、发展中起着一定的作用。邱芳等[4]应用免疫组化技术检查乳腺癌中Caspase3蛋白表达情况，其结果与本研究一致。个别报道[5]中Caspase3在乳腺癌组织及细胞中有过表达,认为其参与了乳腺癌的侵袭。对于此现象的发生尚未有确定的解释。另外，本研究中乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性患者生存率比阴性患者生存率有增高的趋势，提示Caspase3蛋白高表达对乳腺癌的发展、转移有一定的抑制作用，患者可能有较好的预后。

　　针对Caspase3的凋亡作用，其可能为人们提供更直接、更有效的基因治疗新策略。方勇等[6]的研究提示，在紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡过程中，Caspase途径起着重要的作用，阻断该途径能减弱紫杉醇所诱导的肿瘤细胞凋亡。Yang等[7]研究中重构型Caspase-3使乳腺癌细胞系MCF-7中的Caspases-3, -6, -7的活性上调，进而使MCF-7对阿霉素及异托铂苷诱导的凋亡敏感性增强从而加强阿霉素的化疗作用。

　　【参考文献】

　　1] Bratton SB, Macfarlane M, Cain K, et al. Protein complexes activate distinct caspase cascades in death receptor and stress-induced apoptosis [J]. Exp Cell Res, 2000, 256: 27-33.

　　[2] 鲍炜, 张立红. 具有自发活性的重组Caspase3对裸鼠SKBr-3肿瘤生长的抑制[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2004,20(1):23-26.

　　[3] 张立红,贾林涛. 重组逆病毒介导ImmunoCaspase-3 分泌性 T 细胞对ErbB2 阳性乳腺癌的杀伤作用[J]. 科学通报,2004,49(11):1056-61.

　　[4] 邱芳,彭松林,戴显伟. c-FLIP、bcl-xS和Caspase-3在乳腺癌中的表达及其临床意义[J].现代肿瘤医学, 2008,16(7):1145-1148.

　　[5] Zapata JM, Krajewska M, Krajewska S, et al .Expression of mutiple apoptosis-regulatory genes in human breast cancer cell line and primary tumors [J]. Breast Cancer Res Treat, 1998, 47(2):129-140.

　　[6] 方勇,吴金民,潘宏铭,等.Caspase-3抑制剂减弱紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡[J].实用肿瘤杂志,2004,19(2):120-123.

　　[7] Yang X H, Sladek T L, Liu X S, et al. Reconstitution of caspase 3 sensitizes MCF-7 breast cancer cells to doxorubicin and etoposide-induced apoptosis [J]. Cancer Res, 2001, 61(1): 348-354.