血管内皮生长因子在肝细胞癌中的表达及其临床价值

　　作者：万骋,崔斐,陈斌,陈锦章,黄宇贤　　作者单位：南方医科大学南方医院肿瘤中心， 广东 广州 510515

　　【摘要】 目的：探讨肝细胞肝癌(HCC)组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达相关性及其临床意义。方法:应用免疫组织化学方法检测50例HCC组织和20例正常肝组织中VEGF蛋白的表达，并将检测结果与临床病理特征进行综合分析。结果:①50例HCC组织中VEGF蛋白的阳性表达率为68.0% (34/50)，在正常肝组织中的表达率为10% (2/20)，差异有显著性;②VEGF蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度，AFP值无相关性(P>0.05)，而与临床分期及转移相关(P<0.05)。结论:VEGF蛋白在HCC中表达率较高，为肝癌的分子靶向治疗提供了新的靶点;VEGF在HCC中的表达关系密切，测定HCC中VEGF蛋白的表达，有助于临床判断病人预后。

　　【关键词】 肝细胞癌; VEGF; 靶向治疗; 免疫组化

　　VEGF in Hepatocellular Carcinoma and Their Clinical Values

　　WAN Cheng， CUI Fei， CHEN Bin， et al

　　(Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangdong Guangzhou 510515, China)

　　Abstract：Objective： To discuss the expression of VEGF in hepatocellular carcinoma and their relationship and their clinical values.Method: The expression of VEGF in hepatocellular carcinoma were studied by immunohistochemical technique，and then analyzed the relation between studied outcome with clinical pathologic character.Result: ①The 34 of 50 hepatocellular carcinoma specimens (68.0%) were positive for VEGF.The 2 of 20 hepatocellular carcinoma specimens (10%) were positive for VEGF.The expression of VEGF are significant difference between hepatocellular carcinoma and normal hepatic tissue.②VEGF expression was not associated with sex，age，tumor size，degree of differentiation and alpha fetoprotein figure (P<0.05);and were related to clinical stage and lymph node metastasis of hepatocellular carcinoma patients (P<0.05).Conclusion: VEGF are over-expressed in HCC tissues，and provide a theoretical basis for application of molecular targeted drugs.Detecting the expression of VEGF in HCC tissues can shed light on the judgement the prognosis and guide treatment for patients.

　　Key words： Hepatocellular carcinoma; VEGF; Targeted therapy; Immunohistochemical technique

　　原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)(以下简称“肝癌”)是恶性程度最高的肿瘤之一，高复发且预后差。探讨肝癌的生物学特性与复发及预后的关系，是当今肝癌研究的一大热点。国内外研究表明肝细胞癌的预后与某些分子指标有关[1]，其中血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)是近年研究的热点之一。但对其在肝癌中表达的相关性及临床意义，研究结果却不尽相同。本研究旨在检测肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中VEGF蛋白的表达，分析它们与各临床病理参数的关系，探讨他们之间的相关性及其临床意义，为肝癌的临床诊断和综合治疗提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 标本:收集2004年1月至2006年1月在南方医院手术切除并经病理确诊为肝细胞癌且临床病理资料完全的50例患者标本作为实验组。所有病例术前均未行放化疗和其他治疗，男性40例、女性10例，年龄31～69岁，平均53.7岁。病理分级按Edmandson分级情况分为Ⅰ级14例，Ⅱ级21例，Ⅲ级～Ⅳ级15例。临床分期按UICC(1997)分期标准，Ⅰ期6例，Ⅱ期29例，Ⅲ期13例，ⅣA期2例。用20例意外死亡(生前体健)经HE染色切片诊断证实无病变的成人肝脏标本作为对照组。对照组中男性13例、女性7例，年龄30～72岁，平均52.9岁。

　　1.1.2 试剂：VEGF鼠抗人单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司。试剂盒选用即用型免疫组化EliVisionTM 广谱染色试剂盒。

　　1.1.3 仪器：石蜡切片机(山东 AS325);显微镜(Olympus BX40);电热恒温干燥箱(56～65℃，上海跃进医疗器械一厂，标准号：ZBY149-83，型号:GZX-DH-50×55)。

　　1.2 方法：免疫组化采用EnVisionTM法，具体操作步骤如下：65℃烤片2～4h;石蜡切片脱蜡至水;蒸馏水冲洗2min;抗原修复：本实验用法为浸泡于枸橼酸盐缓冲液(PH 6.0)中，在功率850W的微波炉中加热20min，放至室温后用蒸馏水冲洗2min;浸泡于3%H2O2中，在功率350W的微波炉中加热3min，以消除内源性过氧化物酶的活性;蒸馏水冲洗2min;PBS冲洗，3min×3次;滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1h或者4℃过夜;PBS冲洗，3min×3次;滴加二抗，37℃孵育30min;PBS冲洗，3min×3次;DAB显色5min;自来水充分冲洗，复染;脱水，透明，封片。

　　1.3 结果判断:每批实验设阳性和阴性对照。阴性：细胞膜无棕黄色颗粒样沉淀;阳性：细胞膜有棕黄色颗粒样沉淀。染色分级：整张切片无一个阳性细胞(-);阳性细胞数<10%(+);阳性细胞数10%～50%(++)，阳性细胞数>50% (+++)。

　　1.4 统计学处理:采用X2 检验和Fisher's精确概率法。所有资料均以SPSS13.0软件行统计学处理，P﹤0.05为显著性检验标准。

　　2 结果

　　2.1 VEGF蛋白在HCC中的表达:VEGF蛋白阳性反应信号主要位于胞浆，少部分位于胞膜，其表达呈明显的异质性。VEGF蛋白在50例HCC中的阳性表达率为68.0% (34/50)，在20例正常肝组织中的表达率为10% (2/20)。

　　2.2 VEGF表达与HCC临床病理特征间的关系：VEGF蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、AFP值无相关性(P>0.05)，而与临床分期及转移相关(P<0.05)。

　　VEGF蛋白在HCC中的表达(EV法，×200)

　　A. 中分化肝细胞癌，VEGF表达(-);B. 中分化肝细胞癌，VEGF表达(+);C. 中分化肝细胞癌，VEGF表达(++);D. 中分化肝细胞癌，VEGF表达 (+++)

　　VEGF表达与HCC临床病理特征间的关系

　　3 讨论

　　血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)又称血管通透性因子，是一种糖基化多肽性分泌因子。VEGF广泛分布于人和动物体内的脑、心、肾、肝、脾、肺、胃、眼等组织和细胞中。肿瘤的生长、浸润和转移依赖于肿瘤血管生，VEGF能通过旁分泌形式特异性作用于血管内皮细胞，通过促进内皮细胞增殖、增加血管通透性，以诱导肿瘤血管生成，在肿瘤的发生发展中起关键作用[2]。

　　本实验结果显示VEGF蛋白在肝癌中的表达明显高于正常肝组织，表明其与HCC 发生发展密切相关，可能是参与抑制恶性肿瘤细胞的凋亡及促进肿瘤新生血管形成过程中的关键因素。本实验中还发现VEGF蛋白表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、AFP值无相关性(P>0.05)，而与临床分期及转移相关(P<0.05)，故对VEGF 均为阳性表达的HCC 患者，我们应定期给予密切随访以期及早发现肿瘤转移、复发，并加强术后辅助治疗，改善预后。

　　VEGF是目前发现的诱导肿瘤血管形成作用最强和最特异的生长因子，VEGF/VEGFR信号转导通路被认为是最有前途的靶点。贝伐单抗 (Bevacizumab，商品名：阿瓦斯丁，Avastin)是一种基因工程mAb药物，主要通过抑制VEGF发挥作用。2004年获美国批准上市，是第一种采用“饿死肿瘤”技术的抗癌新药，在转移性结肠、直肠癌中配合化疗作为一线药物[3,4]。一项Ⅱ期临床实验表明[5]，贝伐单抗联合健择和奥沙利铂用于33例晚期肝癌，30例被评价为有效。此研究为肝癌的综合治疗提供了一条新思路，为抗血管生成药物Avastin等在肝癌的应用提供了理论依据，丰富了肝癌综合治疗体系。但目前大多数抑制血管生成药物尚处于Ⅰ，Ⅱ期临床试验阶段，在应用于临床之前还要克服许多问题，尚需要大量的临床试验以确定其长期应用的价值。

　　本研究测定肝癌组织中VEGF蛋白的表达，有助于临床判断病人预后，为Avastin等分子靶向治疗药物在肝癌的应用提供了理论依据。相信不久的将来，有更多的患者可以因此受益。

　　【参考文献】

　　[1] 罗荣城，韩焕兴.肿瘤生物治疗学[M].第1版.北京：人民卫生出版社，2006.477-491.

　　[2] Bachelder RE，Crago A，Chung J，et al.Vascular endothelial growth factor is an autocrine survival factor for neuropilin-expressing breast carcinoma ce1l[J].Cancer Res，2001，61：5736-5740.

　　[3] Zondor SD，Medina PJ.Bevacizumab：an angiogenesis inhibitor with efficacy in colorectal and other malignancies[J].Ann Pharmacother，2004，38：1258-1264.

　　[4] Ferrara N，Hillan KJ，Novotny W，et al.Bevacizumab (Avastin)，a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy[J].Biochem Biophys Res Commun, 2005，29，33 (2)：328-335.

　　[5] Zhu AX，Blaszkowsky LS，Ryan DP，et al.Phase II study of gemcitabine and oxaliplatin in combination with bevacizumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma[J].Clin Oncol.2006，24：1898-1903.