RUNX3与消化系肿瘤关系的新进展

　　作者：李林芳,倪志　　作者单位：海南医学院海南省药物安全性评价研究中心，海南 海口

　　【关键词】 肿瘤;基因;甲基化;杂合子丢失

　　近年来研究证实，消化系恶性肿瘤是由于抑癌基因失活，癌基因被激活、端粒酶激活及感染等引发的多因素、多阶段及多基因变异的综合性病变过程。RUNX3(runtrelated trscription factor 3 gene)是新近发现的一种抑癌基因，他是RUNT家族成员之一。人类RUNX家族是由RUNX1、RUNX2、RUNX3三个成员组成，他们都是重要的转录因子。最近通过对RUNX3研究发现，其在人类多种消化系恶性肿瘤发生过程中起着重要的作用而倍受关注[16]。现将RUNX3基因的结构功能及其在多种消化系恶性肿瘤发生中的作用和致病机制的研究现状作一综述。

　　1 RUNX3基因及其蛋白的结构

　　人类RUNX3基因位于1q36.1，基因全长67 kb，主要由P1(distal)和P2(proximal)2个启动子，6个外显子和1个超过基因全长一半的内含子1(35 kb)组成。RUNX3是RUNX家族中最小且最保守的一个基因，其结构和家族其他两个成员结构非常相似，都含有1个RD(Runt domain)保守域。启动子P1和P2间距较远，被内含子1和外显子1所分隔，两者均不含TATA盒而含有CCAAT盒及E盒，2个启动子均含有数个分散的转录起始点(transcription start site， TSS)。RUNX3　mRNA主要由P2转录，P2转录后包含1个373 bp的5′-非编码区(untranslateed region，UTR)，1个2 554 bp的3′-UTR及1个1 245 bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)，其中3′-UTR缺乏多聚腺苷尾。P1转录后形成1个247 bp的5′-UTR及2个大小分别为17 bp和50 bp的小片段(25)。启动子P2的GC含量较高(64%)，其甲基化的发生几率要高于P1。人类RUNX3基因有3个CpG岛，围绕外显子2(启动子P2嵌套其中)及外显子5附近的位置各有1个CpG岛，另外在外显子6的起始部位也有1个具有高度保守序列的CpG岛。外显子5附近的CpG岛由1个多态小卫星DNA构成，含有25 bp单位的29个重复拷贝[78]。RUNX3广泛表达于多种细胞中，如消化道上皮细胞、间叶细胞、血液细胞及神经细胞等，在细胞生长发育及凋亡中起着重要的作用。

　　人类RUNX3蛋白由415个氨基酸残基构成,与其他2个RUNT转录因子家族成员一样，RUNX3蛋白也是由α和β 2个亚单位构成的异二聚体[7，9]。α亚单位含有1个由RD保守域编码的128个氨基酸链，该链位于α亚单位的氨基端，形成1个S型折叠免疫球蛋白，介导与靶DNA的序列PyGPyGGT结合及与β亚单位相互作用。β亚单位由134个氨基酸残基构成，它通过α亚单位与靶DNA结合，能增强α亚单位与靶DNA的结合力。RUNX3蛋白的羧基端富含脯氨酸和丝氨酸，在对靶基因的转录调控方面起着重要的作用[911]。

　　2 RUNX3基因与消化系恶性肿瘤的相关性

　　2.1 RUNX3与胃癌

　　在动物实验研究中，敲除RUNX3基因的小鼠(RUNX3/)与未敲除RUNX3基因的小鼠相比，其胃黏膜明显的呈过度增生，容易发生胃黏膜上皮癌变。深入研究表明RUNX3敲除的小鼠的胃黏膜上皮细胞对TGFβ诱导的凋亡敏感性降低，细胞凋亡率下降，未敲除RUNX3基因的小鼠的胃黏膜上皮细胞的增生明显地被TGFβ抑制。外源性RUNX3蛋白能明显抑制鼠类的胃黏膜上皮细胞在琼脂糖培养基上生长[2，12]。提示RUNX3被敲除的小鼠胃黏膜上皮细胞过度增生与RUNX3基因缺失而凋亡被抑制有关，RUNX3参与了正常的凋亡调节过程。研究表明将裸鼠接种RUNX3/及p53/小鼠的胃黏膜上皮细胞能导致肿瘤形成，而接种RUNX3+/+及p53/小鼠的胃黏膜上皮细胞的裸鼠未发现形成肿瘤[2]。基于上述动物试验的结果，RUNX3基因被证实参与胃黏膜上皮细胞增生的调控，提示其与人类胃癌的发生可能有关。Li等[2]对15例胃癌细胞株研究发现6/15株(40%)RUNX3表达下调或不表达，其中3株检测为RUNX3杂合性缺失;同时对46例手术切除的原发性胃癌组织研究发现28例胃癌组织RUNX3mRNA无表达或表达下调，其中13例为杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)。研究还证明RUNX3的表达下调比例随肿瘤的演进而升高(P<0.01)。Waki等[13](检测了10株胃癌细胞株和93例原发性胃癌患者的癌组织及其相应的正常胃黏膜组织RUNX3的甲基化现象，发现在7/10株(70%)胃癌细胞，42/93例(45%)胃癌组织及7/93例(8%)相应的正常胃黏膜组织中RUNX3出现甲基化。同时他们还尸检了正常人的胃黏膜组织中RUNX3的甲基化现象，发现仅在1例高龄(≥77岁)死者胃黏膜中出现RUNX3甲基化现象。研究提示除高龄患者外，RUNX3甲基化具有恶性肿瘤特异性，可能成为胃癌早期诊断的标志物。Oskai等[14]研究发现RUNX3蛋白在正常胃黏膜上皮细胞表达，而在肠化生及胃癌细胞中则未见表达。上述研究证实，RUNX3能抑制肿瘤的发生，RUNX3基因失活与胃癌的发生具有相关性。已有研究证实RUNX3失活或表达下调不仅与胃癌的发生有关，而且和肿瘤的演进也密切相关[15]。

　　2.2 RUNX3与结直肠癌

　　Ku等[6]应用甲基化特异性PCR技术(methylationspecific PCR，MSP)对87例手术切除的原发性结直肠癌组织及其对应的正常肠黏膜组织进行分析，发现16/87例(18.4%)的癌组织RUNX3基因出现甲基化，而相对应的正常的肠黏膜组织未发现RUNX3甲基化。对32例人类结直肠癌细胞株RUNX3基因的DNA进行分析发现，6/32例(18.8%)出现RUNX3杂合性缺失，而正常结直肠细胞没有发现RUNX3杂合性缺失现象。应用RT-PCR技术对同样32例结直肠癌细胞株的RUNX3mRNA进行检测，发现16/32例(50%)结肠癌细胞株RUNX3不表达或表达下调[6]。Goel等[16]应用MSP技术对91例原发性结肠癌和17例人类结肠癌细胞株的RUNX3基因的启动子甲基化进行分析，发现19/91例(21%)结肠癌及11/17例(65%)结肠癌细胞株RUNX3启动子存在高甲基化现象。上述研究表明RUNX3与人类结直肠癌有密切相关性。

　　2.3 RUNX3与其他消化系恶性肿瘤

　　Torquati等[17]应用免疫印迹技术对食管腺癌细胞株SEG-1的RUNX3的蛋白表达进行检测，发现SEG-1缺乏RUNX3蛋白的表达，提示SEG-1细胞株RUNX3失活。Xiao等[18]应用PCR-SSCP技术对62例原发性肝癌的手术切除标本及其对应的正常肝组织进行分析，发现26/62例(41.9%)癌组织有RUNX3杂合性缺失现象，其中9/26例(34.6%)是等位基因缺失;同时应用MSP研究发现30/62例(48.4%)的癌组织的RUNX3出现高甲基化状态，而正常的肝组织未发现RUNX3高甲基化。该研究表明RUNX3的杂合性缺失及异常高甲基化可能是原发性肝癌的重要发病机制。Wada等[5]研究10株胆管癌细胞株发现7/10例(70%)RUNX3无表达。Kim等[19]对124例原发性胆囊癌及7株胆管癌细胞株发现，73%(90/124)的胆囊癌病例中出现RUNX3高甲基化，而86%(6/7)胆管癌细胞株发现RUNX3因高甲基化表达失活;另有研究发现56.8%的原发性胆囊、胆管癌患者的RUNX3基因有高甲基化现象，而正常胆囊组织未发现这种现象[20]，提示RUNX3甲基化可能与原发性胆囊癌相关。Wada[5]等应用RT-PCR及Northern blot技术对12株胰腺癌细胞株研究发现9/12例(75%)不表达RUNX3;Li等[21]应用半定量PCR及免疫组化技术研究发现正常的胰腺组织除胰岛组织外均不表达RUNX3，而胰腺癌组织中有7/24例RUNX3表达增高，RUNX3的表达位于癌细胞和被侵犯的淋巴细胞中。上述研究表明，RUNX3在胰腺癌细胞株和癌组织中的表达存在差异，还有待进一步研究。

　　2.4 RUNX3失活与恶性消化系肿瘤

　　RUNX3失活与恶性消化系肿瘤的发生密切相关，RUNX3失活主要是基因的甲基化和杂合性缺失导致的。基因的甲基化在导致肿瘤抑癌基因失活方面具有极为重要的作用。研究表明[2，14]，45%～60%的胃癌患者因位于P2启动子区域附近的CpG岛出现甲基化而导致RUNX3不表达或表达下调，而对于晚期癌症患者这个比例则上升到90%。5′-氮唑2′-脱氧胞苷(deoxycytidine，AZA)是一种DNA甲基转移酶抑制剂，曲古抑菌素(trichostatin，TSA)是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在体外研究中他们能使CpG岛的甲基化失活的基因去甲基化重新激活表达。多种不表达RUNX3胃癌、结直肠癌细胞株在加入AZA或TSA或两者的条件下培养后，均能逆转RUNX3重新表达[2，6，22]。这提示我们可以研究以RUNX3为基因治疗靶点，诱导因甲基化失活的RUNX3重新表达的方法对相关肿瘤进行基因治疗。杂合性缺失是导致抑癌基因失活的另一重要方式。Li等[2]研究表明在28例RUNX3不表达或表达下调的胃癌组织中，有13例均检测出有RUNX3杂合性缺失;而在检测出杂合性缺失的14例胃癌组织中，13例均显示RUNX3表达缺失，表明了杂合性缺失与RUNX3表达下调有关(P<0.05)。在对肝癌的研究中也得到相似结论。RUNX3的基因突变与肿瘤发生是否有关尚难以评价。Li等[2]对119例胃癌组织运用PCR-SSCP技术检测RUNX3有无突变，仅发现1例癌组织出现突变，突变位点位于RD保守域的第122位的精氨酸转变为半胱氨酸(R122C)，但这组病例未做正常组织配对对照。为证实R122C突变是否会导致RUNX3失活，分别将外源性RUNX3及突变的RUNX3(R122C)分别转染至不表达RUNX3的胃癌细胞株MKN28，并将被转染细胞分别植入裸鼠体内。研究发现转染了外源性RUNX3的肿瘤细胞MKN28在裸鼠体内生长明显受抑制，而转染突变的RUNX3(R122C)的肿瘤细胞则生长迅速。Guo等[22]分别将外源性正常的RUNX3及突变的RUNX3(R122C)转染至不表达RUNX3的胃癌细胞株MKN74，用克隆形成法评价细胞生存率，结果提示突变型RUNX3(R122C)使RUNX3的活性降低或失活。上述研究提示RUNX3基因突变可能与肿瘤发生有关。Xiao等[18]对62例肝癌组织研究表明未发现RUNX3基因突变。鉴于目前所发现的肿瘤RUNX3突变的频率很低，故突变与肿瘤的相关性还有待进一步研究。

　　3 RUNX3的抑癌机制

　　研究证明，RUNX3/的胃黏膜上皮细胞的过度增生和凋亡减少与细胞对TGFβ诱导的凋亡敏感性降低有关，TGFβ作为增生抑制因子其诱导凋亡的作用在RUNX3/的胃黏膜上皮细胞中完全失活[1，2，12]。结果提示抑癌基因RUNX3的抑癌机制与TGFβ信号途径有关。TGFβ是多种细胞的生长抑制因子，活性TGFβ通过与具有丝氨酸/苏氨酸活性激酶的跨膜TGFβ超家族受体Ⅰ和Ⅱ配位结合，诱导这2种受体相互结合形成由2个受体Ⅰ和2个受体Ⅱ组成的具有活性异四聚体复合物——TβRC，通过该复合物介导产生细胞内生物学效应[1]。Smads是TGFβ下游信号传导蛋白,Smads蛋白介导了TGFβ依赖性的细胞凋亡。Smads蛋白一般分为3型：受体调控型Smads(receptorregulated Smads, RSmads)辅助型Smads(commonpartner Smads，CoSmads)和抑制型Smads(inhibitory Smads，ISmads)，RSmads包含Smads1，2，3，5和8;Smads4是哺乳动物唯一的CoSmad，ISmads包含Smads6和Smads7。RSmads可以通过Smad锚定激活受体(smad anchor for receptor activator，SARA)被锚定于细胞膜上，继而被TβRC磷酸化激活与CoSmad结合形成R-Smad-Co-Smad复合物，该复合物转移到细胞核内与RUNX3转录因子及转录辅助因子如p300、mSIN3A、YAP和Ear2等共同调节靶基因的转录。研究表明，RUNX3与Smad2、Smad4及p300共同组成抑癌复合物，该复合物可能通过 TGFβ信号途径调控Bim基因发挥相关生物学作用[2325]。上述研究表明，RUNX3转录因子在TGFβ信号途径起着关键的作用，RUNX3的畸变可以导致TGFβ信号途径紊乱，引起TGFβ信号失活，进而引起细胞的凋亡障碍，从而导致肿瘤发生。

　　4 展望

　　RUNX3作为一个新发现的抑癌基因，在调控细胞的生长发育和细胞凋亡的过程中发挥着重要而复杂的转录调节作用。RUNX3基因的缺失或失活都可导致多种消化系恶性肿瘤的发生。RUNX3可能成为一个消化系恶性肿瘤的生物学标志和肿瘤基因治疗的靶点。为消化系恶性肿瘤的诊断和治疗提供了一条新途径。但是有关RUNX3基因的功能、表达的调节机制、RUNX3转录因子的作用机制、调控消化系恶性肿瘤发生的作用机制及其表达与临床治疗与预后的关系尚不十分清楚，有待进一步研究。

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