骨肉瘤组织中MICA基因mRNA和蛋白的表达

　　作者：卢善明,薛玲　肖萍,李扬　　作者单位：1. 汕头大学医学院附属第一医院病理科， 广东 汕头 515041; 2. 中山大学附属第一医院病理科， 广东 广州 510080; 3. 宾夕法尼亚大学放射科分子图像室， 费城 宾夕法尼亚州

　【摘要】 【目的】 检测骨肉瘤组织中MHC I类链相关蛋白A(MHC class I chain-related A，MICA)基因mRNA和蛋白的表达情况，为探讨骨肉瘤的肿瘤免疫机制提供信息。 【方法】 应用RT-PCR方法检测MICA mRNA在11例新鲜骨肉瘤组织和5个骨肉瘤细胞株中的表达情况;分别应用免疫组织化学方法、Western blot和流式细胞术检测66例石蜡包埋骨肉瘤组织、6例石蜡包埋正常人骨组织、9例新鲜骨肉瘤组织和5个骨肉瘤细胞株中MICA蛋白的表达情况。 【结果】 骨肉瘤组织中MICA mRNA表达率为81.8%(9/11)，5个骨肉瘤细胞株均表达MICA mRNA;MICA蛋白在骨肉瘤组织和正常骨组织的表达率分别为51.6%(34/66)和0%(0/6);骨肉瘤细胞株Saos-2、MG63和HOS阳性表达膜表面MICA蛋白，而细胞株U2OS和OS732只有少量细胞呈阳性表达。【结论】 MICA mRNA和蛋白广泛表达于骨肉瘤组织和细胞株。

　　【关键词】 骨肉瘤; MHC I类链相关蛋白A; MICA; 表达

　　Expression of MICA mRNA and Protein in Osteosarcoma

　　LU Shan-ming1， XUE Ling2*， XIAO Ping2， LI Yang2， CAO Qing-hua2， QIAO Hui3　(1. Department of Pathology， The People's Hospital of Dongguan， Dongguan 523018， China;　2. Department of Pathology， The First Affiliated Hospital， SUN Yat-Sen University， Guangzhou 510080， China;　3. Molecular Imaging， Department of Radiology， University of Pennsylvania， Philadelphia， PA 19104， USA)

　　Abstract： 【Objective】 To investigate the expression of MICA mRNA and protein in osteosarcoma and give a more comprehensive understanding to its immune evasion. 【Methods】 RT-PCR was used to analyze MICA mRNA in 11 osteosarcoma tissues and 5 osteosarcoma cell lines. MICA expression was examined in 66 paraffin-embedded osteosarcoma tissues and 6 paraffin-embedded normal bone tissues by immunohistochemistry， and MICA protein in 9 fresh osteosarcoma tissues was detected by Western blot too. MICA surface expression was estimated by flow cytometry. 【Results】 Nine of eleven (81.8%) osteosarcoma specimens and all of the five cell lines consistently expressed MICA mRNA. Up-regulation of MICA expression was found in osteosarcoma (34/66， 51.6%)， compared with normal bone tissues (0/6， 0%). The cell lines Saos-2， MG63， and HOS showed positive surface MICA expression， while the U2OS and OS732 showed very limited expression. 【Conclusion】 MICA mRNA and protein predominantly expressed on osteosarcoma tissues and cell lines.

　　Key words： osteosarcoma; MHC class I chain-related A; MICA; expression

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(4)：441-445]

　　MHC I 类链相关蛋白A(MHC class I chain-related A，MICA)位于人类HLA 基因位点内，编码非经典 HLA-I类分子。正常状态下MICA只表达于极少数特定的组织，当细胞发生转化或受到感染等应激性刺激时则出现过度表达，并和免疫细胞表面的NKG2D受体结合，激活免疫细胞对转化和感染细胞的细胞毒作用[1]。因此，NKG2D-MICA介导的免疫监视作用在抗肿瘤免疫中起一定的作用。MICA在许多上皮性肿瘤都表达上调[2-5]，但关于其在人肉瘤组织中表达的报道罕见。我们曾用免疫组织化学方法检测了43例骨肉瘤中MICA蛋白的表达情况[6]，本研究在前期工作基础上更为深入地从mRNA水平和蛋白水平探讨骨肉瘤组织和细胞的MICA表达情况，为更深入了解骨肉瘤的肿瘤免疫机制提供理论基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 标 本

　　1.1.1 石蜡标本 收集中山大学附属第一医院2003年至2006年骨肉瘤穿刺和活检标本存档蜡块共66例，其中男性40例，女性26例，年龄8 ～ 52岁，平均年龄19(S = 9)岁。所有患者术前均未接受放疗、化疗，并经病理切片检查确诊为骨肉瘤。另收集6例正常骨组织作对照。

　　1.1.2 新鲜组织 收集上述骨肉瘤病例中11例新鲜骨肉瘤组织，-80 ℃保存。

　　1.1.3 细胞株 人骨肉瘤细胞株Saos-2、U2OS、HOS、MG63、OS732及作为阳性对照的Hela细胞株均由本教研室保存。

　　1.2 逆转录-PCR(RT-PCR)

　　按TRIzol Reagent说明书提取细胞和组织的总RNA。①将上述6种细胞分别接种于6孔板，当细胞处于80%汇合时，吸尽细胞培养上清液，加入1 mL TRIzol(Invitrogen)提取总RNA;或称取组织100 mg，于液氮内磨碎后移到加有1 mL TRIzol的玻璃匀浆器中，冰上匀浆后提取总RNA。cDNA第一链的合成按逆转录试剂盒(Fermentas)说明书操作。② PCR扩增：采用GAPDH基因作内参照，以蒸馏水替代cDNA作为阴性对照，阳性对照为Hela细胞cDNA。MICA基因引物序列如下(由广州英骏生物技术有限公司合成)。MICA sense： 5′-GTGCCCCAGTCCTCCAGAGCTCAG-3′， antisense： 5′-GTGGCATCCCTGTGGTCACTCGTC-3′(产物635 bp);GAPDH sense： 5′-CACTGACACGTTGGCAGT GG-3′，antisense： 5′-CATGGAGAAGGCTGGGGCTC -3′ (产物410 bp)。③PCR反应条件：95 ℃预变性5 min;循环条件为95 ℃ 40 s;65 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min;共30个循环，最后72 ℃ 延伸10 min。④1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，MICA、GAPDH基因的目的条带大小分别为635 bp和410 bp。

　　1.3 免疫组织化学染色

　　1.3.1 染色方法 采用SP法检测石蜡包埋骨肉瘤组织中MICA蛋白的表达。石蜡切片常规脱蜡至水后，0.1 mol/L柠檬酸钠(pH 6.0)抗原修复液微波修复抗原，30 mL/L过氧化氢阻断内源性过氧化物酶和正常血清封闭20 min。然后滴加羊抗人MICA抗体(R﹠D Systems， 1：100稀释)，4 ℃过夜;按兔抗羊SP试剂盒(北京中山生物技术有限公司)说明书滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物。最后DAB显色，苏木素衬染，镜下观察。对照设定：用PBS或正常山羊血清代替一抗作阴性对照;用阳性表达MICA蛋白的结肠癌切片作阳性对照。

　　1.3.2 结果判定 MICA蛋白染色阳性信号位于胞膜和胞浆。免疫组化染色的分级标准以阳性细胞的百分比和着色强度为依据;穿刺标本，评估整张切片;活检标本，随机选择3个高倍视野进行评估。着色强度评分：无着色为0分;淡黄色为1分;棕黄色或棕褐色为2分。阳性细胞百分比评分：阳性细胞数 < 5%，0分;5 ～ 25%，1分;26% ～ 50%，2分; > 50%，3分。两个分值相加为免疫组化染色的最终评分，并按下述标准分级：0分，阴性表达(-);2分，弱表达(+);3 ～ 4分，中等表达，(+ +);5分，强表达，(+ + +)。

　　1.4 Western blot

　　采用总蛋白提取液RIPA试剂盒(上海申能博彩公司)提取新鲜骨肉瘤组织总蛋白，并用BCA法(上海申能博彩公司)测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE电泳，转膜后进行抗原抗体反应。一抗：羊抗人MICA抗体(R﹠D Systems， 1：400稀释)，鼠抗人β-Actin抗体(北京中山生物技术有限公司，1：5 000稀释)，4 ℃过夜。二抗：HRP标记的兔抗羊IgG抗体(北京中山生物技术有限公司，1：5 000稀释)，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(北京中山生物技术有限公司，1：5 000稀释)。ECL发光液发光，X线底片曝光。

　　1.5 流式细胞术

　　收集细胞，各取100 μL 细胞悬液(约含106细胞)加入50 μL羊抗人MICA抗体和阴性对照羊单抗IgG1，室温避光反应30 min。PBS洗涤后加入50 μL FITC 标记兔抗羊IgG，室温暗处孵育30 min。PBS洗涤后加入500 μL PBS，上机观察。

　　2 结 果

　　2.1 临床病理特点

　　66例骨肉瘤组织，其中男性40例，女性26例，男女比例为1.5：1。年龄8 ～ 52岁，平均年龄19(S = 9)岁，其中16岁及以下患者占52%。组织学类型包括：骨母细胞为主型(40/66， 60.6%)、软骨母细胞为主型(10/66， 15.2%)、纤维母细胞为主型(6/66， 9.1%)、混合型(4/66， 6.1%)、血管扩张型(5/66， 7.6%)、骨膜型(1/66， 1.4%)，多为中低等分化(56/66， 84.8%)，好发于股骨和胫骨(57/66， 86.4%)。19.7%(13/66)患者出现转移，主要是肺转移，18.2%(12/66)患者出现术后复发。

　　2.2 骨肉瘤组织和细胞株对MICA基因mRNA和蛋白的表达

　　本实验共检测了5株人骨肉瘤细胞株和11例人骨肉瘤组织中MICA mRNA的表达。

　　免疫组化结果表明，MICA蛋白表达于胞浆和胞膜。6例正常骨组织均阴性表达MICA蛋白，66例骨肉瘤组织中MICA蛋白表达率为51.6%(34/66)，其中，强阳性率为18.2% (12/66)、中等阳性率为33.4%(22/66)、弱阳性率为24.2%(16/66)和阴性表达率为24.2%(16/66)。MICA蛋白为跨膜蛋白，可以采用流式细胞术检测骨肉瘤细胞的膜表面MICA蛋白。骨肉瘤细胞株Saos-2、MG63和HOS阳性表达膜表面MICA蛋白，而细胞株U2OS和OS732几乎不表达。

　　为了验证免疫组化染色的可靠性，我们用Western blot检测了9例阳性表达MICA mRNA的骨肉瘤组织中MICA蛋白的表达，结果这9例骨肉瘤组织及阳性对照Hela细胞均于55 kDa处可见条带，另阳性对照和4例骨肉瘤于65 kDa处还可见另一条带(图4)。MICA蛋白是个高度糖基化的蛋白，这些条带均位于文献所报道的MICA蛋白的分子量范围内[7]。Western blot检测结果与免疫组化结果相一致。

　　3 讨 论

　　3.1 MICA表达的临床病理意义

　　MICA蛋白是人类免疫细胞表面NKG2D受体的主要配体。MICA蛋白和NKG2D受体的结合，直接激活NK细胞和γδ T细胞介导的细胞毒作用;细胞毒性T(CTL)淋巴细胞的活化需要双重刺激信号，MICA-NKG2D的结合为CTL的活化提供共刺激信号[1];此外，NKG2D还可以替代CD28向CD28- CD8+ 记忆性T 淋巴细胞提供共刺激信号，使其活化并产生抗肿瘤免疫记忆[1]。本研究从mRNA水平和蛋白水平检测了骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞株中MICA的表达情况。结果表明，MICA mRNA和蛋白在骨肉瘤组织的表达率为82%和51.6%，骨肉瘤细胞株亦检测到MICA mRNA和蛋白的表达。

　　MICA蛋白表达与肿瘤生物学行为间的关系仍待研究。Watson等[2]对449例结直肠癌MICA表达的研究发现，MICA与结直肠癌临床病理特点不相关，但高表达MICA的结直肠癌患者预后较好，MICA表达可作为良好预后的指标。Madjd等[3]对540例乳腺癌研究发现，MICA蛋白表达与乳腺癌分级、淋巴结转移、血管浸润、肿瘤组织类型相关。组织学分级为3级且预后差的乳腺癌MICA表达较高，MICA表达可作为乳腺癌预后不良的指标。我们课题组对43例骨肉瘤MICA蛋白表达的研究发现，分化好和早期的骨肉瘤MICA蛋白表达较高[6]。这些研究表明，不同肿瘤中MICA蛋白表达对肿瘤生物学行为的影响不一致，反映了MICA表达对肿瘤形成、进展过程中的影响是多方面的。

　　3.2 MICA表达与肿瘤免疫

　　MICA是NKG2D受体的主要配体，实验表明，通过基因转染方法使肿瘤细胞过度表达MICA蛋白可有效增加肿瘤细胞对NKG2D介导细胞毒作用的敏感性，导致肿瘤被清除[5，8]。然而，最近研究表明，MICA蛋白的表达也可以对免疫系统产生抑制作用。Oppenheim等[9]报道NKG2D配体的持续性表达可下调免疫细胞NKG2D受体表达。此外，MICA蛋白表达能强烈抑制T 细胞增殖[10]。NKG2D配体表达的快速改变对肿瘤的发生也产生多方面影响，Strid等[11]发现上调表皮细胞NKG2D配体的表达会诱导γδTCR+ T细胞、朗格罕氏细胞和αβT淋巴细胞在组织内浸润。虽然γδT细胞有助于抑制肿瘤的形成，但朗格罕氏细胞则相反。这些研究可以解释为什么许多恶性肿瘤保留表达具有免疫原性的MICA蛋白。

　　可溶性MICA (soluble MICA， sMICA)蛋白的形成是肿瘤细胞实现免疫逃避的新机制。肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶能水解细胞表面的MICA蛋白，使其脱落形成sMICA，后者能和免疫效应细胞表面的NKG2D受体结合导致受体内化和降解，从而损害NKG2D介导的抗肿瘤免疫监视[12]。骨肉瘤常过度表达基质金属蛋白酶[13]，患者是否存在高血清浓度sMICA呢?我们课题组[14]对16例骨肉瘤患者血清sMICA浓度、外周血淋巴细胞表面NKG2D受体表达情况进行检测，发现骨肉瘤患者血清sMICA浓度高于健康对照组，而NKG2D受体表达低于健康对照组。我们的研究表明，骨肉瘤患者存在MICA蛋白表达上调、血清sMICA含量升高和NKG2D受体表达下调，提示患者可能存在NKG2D介导的免疫监视功能障碍。NKG2D受体表达下调可为IL-2或IL-15所逆转[4]，给MICA + 骨肉瘤患者使用这些细胞因子可能有助于机体通过NKG2D-MICA介导的细胞毒作用来杀伤肿瘤细胞。

　　总之，MICA mRNA和蛋白广泛表达于人骨肉瘤中，对肿瘤免疫产生双重作用，更好地发挥其免疫活化作用和拮抗其免疫抑制作用将对骨肉瘤免疫治疗开辟一条新的道路。

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