X连锁凋亡抑制蛋白在子宫颈癌组织的表达

　　作者：夏春波,周思,蒋常文,刘健翔,何丽霞　　　作者单位：桂林医学院人体解剖学教研室，广西 桂林 541004

　　【摘要】目的探讨XIAPmRNA表达在子宫颈癌发生发展过程中的作用。方法 通过HE染色从组织病理学上确定子宫颈组织的良、恶性以及恶性组织的分级和分期。应用RTPCR法检测43例子宫颈癌组织和15例慢性子宫颈炎组织中XIAP mRNA的表达情况。结果 子宫颈癌组织XIAPmRNA表达的阳性率为88.37%，明显高于慢性子宫颈炎组织(46.67%)，两者差异显著(P<0.01)。 XIAPmRNA表达随分化程度降低而升高(P<0.01)，有淋巴转移的患者高于无淋巴转移的患者(P<0.05);子宫颈癌组织XIAP mRNA表达与患者年龄、病理分期无关(P>0.05)。结论 XIAP与子宫颈癌发生发展有密切关系;其表达水平的检测对子宫颈癌的病理诊断及其分级有参考价值。

　　【关键词】 子宫颈癌;XIAP基因;RTPCR

　　X连锁凋亡抑制蛋白(Xlinked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是最有效力的caspase抑制物之一，可通过多种途径介导细胞凋亡，近年来发现XIAP蛋白在多种肿瘤中高表达,与肿瘤的分化程度及预后有关，已成为肿瘤基因治疗的新靶点和研究热点〔1，2〕。为此，本实验采用RTPCR法检测子宫颈癌组织和慢性子宫颈炎组织中XIAPmRNA表达情况，以探讨XIAP基因在子宫颈癌发生发展中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 标本来自2006年3月～2007年11月桂林医学院附属医院妇产科门诊，资料收集均取得患者同意，标本大小约为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。43例子宫颈癌组织均未行化疗或放疗，包括子宫颈癌G1级11例、G2级23例、G3级9例。临床分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期16例，Ⅳ期14例。有淋巴转移的13例，无淋巴转移的30例。年龄30～61(平均48)岁，其中50岁以上19例，50岁以下24例。另外取慢性子宫颈炎组织15例作为对照。所有标本均经HE染色证实诊断。标本获取后立即放置到液氮容器内暂时保存，之后转移到-80℃低温冰箱中保存。

　　1.2 主要试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司，Random Primers及RTPCR Kit(K1003S)均购自Promega公司。引物根据NCBI基因库中提供的XIAP(U45880)、βactin(AY582799)cDNA序列，采用引物分析软件Primer Premier 5.0分别在XIAP、βactin基因序列上设计引物。XIAP上游引物5′GGT GAT AAA GTA AAG TGC TTT CAC TGT3′，下游引物5′TCA GTA GTT CTT ACC AGA CAC TCC TCA A3′，产物为188 bp;βactin上游引物5′CAC CAA CTG GGA CGA CA3′，下游引物5′GCA AAG AAC ACG GCT AA3′，产物为498 bp。βactin、XIAP引物均由北京赛百盛基因公司合成。

　　1.3 方法

　　1.3.1 HE染色 标本经常规固定、脱水、透明、切片和HE染色从组织病理学上确定子宫颈组织的良、恶性以及恶性组织的分级和分期。

　　1.3.2 提取组织总RNA 在液氮中将标本研磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移到1.5 ml离心管中，总RNA的提取根据Trizol试剂说明书进行，抽提的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用紫外分光光度计检测其浓度和纯度。

　　1.3.3 反转录及PCR反应 根据RTPCR Kit(K1003S)说明书，将组织总RNA0.5 μg和随机引物0.5 μg反转录合成相应的cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，设置未加cDNA模板的空白对照。PCR反应条件为：预变性94℃ 5min，变性94℃ 40 s，退火50℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，共40个循环，再延伸72℃ 5 min。

　　1.3.4 PCR产物鉴定 取10 μl PCR扩增产物加到含有EB的1.5%琼脂糖凝胶上跑电泳，结果通过全自动数码成像分析系统显示，用Gene Tools from Syn Gene软件分析其条带光密度，计算XIAP基因与内参照βactin的光密度值的比值，代表XIAP mRNA的相对表达水平。每个标本重复3次，取平均值。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验,计量资料以x±s表示，比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 XIAPmRNA在慢性子宫颈炎组织和子宫颈癌组织中的表达 经过PCR扩增，结果XIAP扩增产物片段为188 bp，βactin扩增产物片段为498 bp，与引物设计相符合。15例慢性子宫颈炎组织中有7例(46.67%)XIAPmRNA表达阳性;43例子宫颈癌组织中有38例(88.37%)XIAPmRNA表达阳性;两者差异显著(P<0.01)。

　　2.2 子宫颈癌组织XIAPmRNA表达与病理参数的关系 子宫颈癌组织XIAPmRNA表达与分化程度和淋巴转移有关，分化程度越低XIAPmRNA表达则越高(P<0.01)，有淋巴转移的患者高于无淋巴转移者(P<0.05)，与患者年龄、临床分期无关(P>0.05).子宫颈癌组织XIAPmRNA表达与病理参数的关系

　　3 讨 论

　　XIAP能够对抗各种凋亡诱导因素，抵抗细胞凋亡，在已经发现的凋亡抑制蛋白家族的成员中,XIAP 被认为是作用最强的一种〔3〕。此后的研究发现XIAP存在于多种正常组织，而在多种恶性肿瘤中表达水平明显升高，认为它可能在细胞的增殖过程和细胞向恶性转化过程中发挥重要作用〔4〕。XIAP可以通过3个BIR结构域与凋亡起始因子caspase9和效应分子caspase3、caspase7的结合，抑制caspase分子的活性，通过其他多种信号途径参与抑制凋亡信号引起的细胞凋亡，参与肿瘤细胞的异常增殖〔5〕。Wu等〔6〕研究认为XIAP免疫染色阳性尤其是强阳性时，可提示肿瘤为恶性。本研究应用RTPCR法检测子宫颈癌组织XIAPmRNA表达结果显示，子宫颈癌组织XIAPmRNA表达率较慢性子宫颈炎组织显著增高，推测子宫颈癌组织细胞增殖水平较慢性子宫颈炎组织高，可能出现了凋亡与增殖的失衡，认为XIAP的表达升高可能在子宫颈癌的发生、发展中起重要作用， XIAP可能是促进子宫颈组织恶变的重要因子。XIAP在子宫颈癌组织表达的显著升高对子宫颈癌的诊断具有一定参考价值。XIAP可能通过以下机制抑制细胞调亡:①直接抑制caspase的功能。②通过NFκB途径抑制细胞调亡。③通过参与信号转导途径抑制细胞凋亡。④通过抑制TNFR、Fas/CD95、TRAILR等受体通过死亡受体通路介导引起的细胞凋亡。⑤影响p53功能〔7〕。

　　本研究还显示，子宫颈癌组织XIAPmRNA表达与癌细胞分化程度呈负相关;与淋巴转移有关，但与病理分期和年龄无关，表明XIAP表达强更容易发生转移，迁徙扩散到其他部位形成转移瘤或继发瘤，预后较差;但不能以XIAP的表达水平评估子宫颈癌直接蔓延的范围。Espinosa等〔8〕在研究中发现XIAP表达和子宫颈癌复发有关，但与肿瘤侵袭性成负相关。XIAP在不同子宫颈癌组织中表达的差异，对子宫颈癌的恶性程度和预后的判断具有一定参考价值。

　　近年来针对XIAP开展的RNA干扰和基因治疗研究已取得了较大的进步，已成为肿瘤治疗的新靶点，在肿瘤治疗方面已显示出较大的应用潜能，为肿瘤的治疗提供了新思路。LaCasse〔9〕等运用针对XIAP的反义寡核苷酸特异性的下凋XIAP，诱导肿瘤细胞的凋亡，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。有学者〔10〕设计了针对XIAP的siRNA，研究其在肿瘤细胞系中对XIAP的抑制作用及其抗肿瘤能力，结果发现针对XIAP的siRNA能够显著下凋相应基因及蛋白的表达，增强了TRAIL等诱导的细胞死亡，也增强了肿瘤细胞对一些化疗药物的敏感性。肿瘤的发生是多因素、多途径、多步骤共同作用的结果，然而，XIAP 要应用于肿瘤的临床诊断与治疗还有待进行深入研究。

　　【参考文献】

　　1 Shrikhande SV，Kleeff J，Kayed H,et al.Silencing of Xlinked inhibitor of apoptosis (XIAP) decreases gemcitabine resistance of pancreatic cancer cells〔J〕.Anticancer Res，2006;26(5):326573.

　　2 Li M，Song T，Yin ZF,et al.XIAP as a prognostic marker of early recurrence of nonmuscular invasive bladder cancer〔J〕.Chin Med J，2007;120(6):46973.

　　3 Eckelman BP，Salvesen GS，Scott FL.Human inhibitor of apoptosis proteins：why XIAP is the black sheep of the family〔J〕.EMBO Rep，2006;7(10)：98894.

　　4 Ramp V，Krieg T，Caliskan E，et al.XIAP expression in an independent prognostic marker in clearcell renal carcinomas〔J〕.Hum Pathol，2004;35(8)：10228.

　　5 Lewis J,Burstein E,Reffey SB,et al.Uncoupling of the signaling and caspaseinhibitory properties of Xlinked inhibitor of apoptosis〔J〕.Biol Chem,2004;279(10):90239.

　　6 Wu M,Yuan S，Szporn AH,et al.Immunocytochemical detection of XIAP in body cavity effusions and washes〔J〕.Mod Pathol,2005;18(12)：161822.

　　7 张亚雷，张世能.凋亡抑制蛋白XIAP与消化系肿瘤关系的研究进展〔J〕.国际内科学杂志，2007;34(11)：6579.

　　8 Espinosa M，Cantu D，Herrera N，et al.Inhibitors of apoptosis proteins in human cervical cancer〔J〕.BMC Cancer，2006;6(1)：45.

　　9 LaCasse EC，ChertonHorvat GG，Hewitt KE，et al.Preclinical Characterization of AEG35156/GEM 640，a secondgeneration antisense oligonucleotide targeting Xlinked inhibitor of apoptosis〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(17)：523141.

　　10 Li Y，Jian Z，Xia K，et al.XIAP is related to the chemoresistance and inhibited its expression by RNA interference sensitize pancreatic carcinoma cells to chemotherapeutics〔J〕.Pancreas，2006;32(3)：28896.