涎腺多形性腺瘤细胞表面糖蛋白表达的初步研究

　　作者：刘芳,赖均鹏,潘昱,刘应时　　作者单位：1.佛山科学技术学院医学院， 广东 佛山 528000　2.广东省佛山市第一人民医院， 广东 佛山 528000

　　【摘要】目的：研究E-cadherein 、CD44v3、CD44v6在涎腺多形性腺瘤中的表达,旨在探讨细胞表面糖蛋白在涎腺多形性腺瘤中表达及意义。方法：应用免疫组化方法检测30例涎腺多形性腺瘤E-cadherein、CD44v3、CD44v6的表达。结果：E-cadherein在涎腺多形性腺瘤阳性(63.3%)表达,CD44v3在涎腺多形性腺瘤阳性(73.3%)表达, CD44v6在涎腺多形性腺瘤中呈强阳性表达(86.7%)。结论：细胞表面糖蛋白表达在涎腺多形性腺瘤呈阳性表达，提示瘤细胞同质粘附力较强，可能是涎腺多形性腺瘤不易发生浸润、转移的原因。

　　【关键词】 涎 腺; 多形性腺瘤; E-cadherein; CD44v3; CD44v6

　　Expression in Cell Surface of Polymorphic Adenoma of Salivary Glands

　　LIU Fang, et al

　　(Medical College of Foshan Science and Technology University,

　　Guangdong Foshan 528000, China)

　　Abstract： Objective:To investigate the expression of E-cadherein ,CD44v3 and CD44v6 in the polymorphic adenoma of salivary glands. Method: Using immunohistochemistry technology to detect the expression of E-cadherein, CD44v3 and CD44v6 in 30 cases of polymorphic adenoma of salivary glands. Result: The expression of CD44v3 was positive in 73.3% cases within 30 paraffin-embedded sections, compared with E-cadherein (63.3%), while CD44v6, 86.7% were positive. Conclusion: The high expression of E-cadherein ,CD44v3 and CD44v6 maybe the reason of the low invasive ability and migration of polymorphic adenoma of salivary glands.

　　Key words： Salivary glands; Polymorphic adenoma; E-cadherein; CD44v3; CD44v6

　　肿瘤细胞的侵袭能力与细胞表面起粘附作用的糖蛋白密切相关。肿瘤细胞粘附分子表达降低会导致细胞之间粘连松散,并具有明显的浸润生长趋势。E-钙粘蛋白( E-cadherein ,E-cad)、CD44v3 CD44v6是与肿瘤细胞粘附有关的糖蛋白，E-钙粘附蛋白的失活与多种人体肿瘤如胃癌、乳腺癌、前列腺癌的侵袭性有关[1],被认为是一种浸润抑制分子。CD44分子是一类具有高度异质性的单链膜表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞及上皮组织中均有广泛表达,在细胞间的粘附、正常和转化细胞的运动和激活中起重要作用[2]。上述三种细胞表面糖蛋白在涎腺多形性腺瘤(Polymorphic Adenoma，PA)中的表达值得关注。本研究采用免疫组化技术检测E-Cad及CD44v3、CD44v6在涎腺多形性腺瘤中的表达,为深入研究涎腺多形性腺瘤复发、转移的机制提供实验依据。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象:收集佛山市第一人民医院2003年至2007年间病理诊断为涎腺多形性腺瘤(PA)30例，均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，HE染色后进行组织学观察，形态学上符合PA的诊断标准。

　　1.2 试剂:E-Cadherin、CD44v3、CD44v6单克隆抗体(鼠抗人) SP9000染色试剂盒及DAB显色试剂盒均为北京中杉金桥公司产品。

　　1.3 免疫组织化学:采用EnVisionTM法： ①石蜡切片常规脱蜡，系列酒精水化至蒸馏水;②微波抗原修复：切片置入盛有PBS液容器中，置微波炉中加热持续2min，室温自然冷却;③蒸馏水漂洗，置于TBS中，10min;④3%过氧化氢溶液灭活内源性过氧化物酶，孵育10min;⑤蒸馏水漂洗，置于TBS中10min;⑥1：100的E-Cadherin CD44v3、CD44v6单克隆抗体(一抗)，孵育30min，TBS漂洗10min;⑦EnVisionTM孵30min，TBS漂洗10min;⑧新鲜配置0.05%DAB显色，显微镜下控制时间，蒸馏水充分冲洗;⑨苏木素轻度复染，脱水、透明、封片。阴性对照以PBS代替一抗;阳性对照用已知阳性片按上述步骤同步进行。免疫组化阳性结果判断标准：以细胞膜呈界限清楚的棕色反应为阳性,切片中无阳性细胞为(-)，阳性细胞数<5%为(+)，5～75%(++ )，>75%为(+++ )。

　　1.4 统计学处理:进行数据用X2 检验和精确概率计算法统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 E-Cadherin表达:正常的涎腺组织中，E-Cadherin呈阳性表达。30例多形性腺瘤石蜡切片E-Cadherin免疫组化染色中, 4例(13.3%)呈强阳性(+++ );9例(30 %)强表达(++ );6例(20 %)弱表达(+);11例(36.7 %)。

　　2.2 CD44v3的表达:切片中正常的涎腺组织中，CD44v3、CD44v6均呈阳性表达，主要见于肌上皮与导管上皮。30例多形性腺瘤石蜡切片CD44v3免疫组化染色中,6例(20%)呈强阳性(+++ );14例(46.7 %)强表达(++ );2例(6.7 %)弱表达(+);8例(26.7 %)。

　　2.3 CD44v6的表达:30例多形性腺瘤石蜡切片CD44v6免疫组化染色中, 12例(40%)呈强阳性(+++ );14例(46.7%)强表达(++ );4例(13.3%)。

　　2.4 E-Cadherin、CD44v3、CD44v6三者的总体阳性率：E-Cadherin阳性率为63.3%，CD44v3阳性率为73.4%，CD44v6在涎腺多形性腺瘤中的阳性表达为86.7%，三者具有一定的差异(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　由细胞表面糖蛋白介导的肿瘤细胞之间的粘附力减弱、瘤细胞与基质的附着力增加是近年来关于肿瘤浸润机制研究的重要进展之一。钙粘附蛋白(Cadherin)是一类主要介导细胞间同质粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白。主要分为三类①分布于上皮组织中的E-cadherein (epithelia cadherin,也称L-CAM)。②分布于神经和肌肉组织中的N-cadherin。③分布于胎盘组织中的P-cadherin。此外还发现了一些新的cadherein分子，如在内皮细胞表达的V-cadherein，在视网膜细胞表达的R-cadherein，在脑组织表达的B-cadherein。

　　E-钙粘附素是钙粘附素家族的一个重要成员, 人类的E-cad 编码基因定位于16 号染色体q22. 1附近,分子中存在一个疏水基因,位于跨膜区,氨基末端位于细胞膜外,是钙离子的结合位点,对Ca2+有高度敏感性,羟基末端位于细胞质内,与肌动蛋白相连,由α、β、γ 3 个亚单位及其他一些连接蛋白组成复合物,对维持细胞形态和调节细胞运动、粘附具有重要作用[3] E-cadherein是研究较多的同质粘附分子。近年来已成为肿瘤细胞侵袭和转移研究的热点之一。近年研究已表明它与肿瘤的发生、分化及转移有关,当肿瘤发生转移时阳性表达降低[4]。研究表明,保留较多来源上皮形态和分化较好的肿瘤,E-cad 的表达量也多;而具有较少来源上皮形态和分化较差的肿瘤,E-cad 的表达量也少。还有文献报道口腔鳞癌中E-cad 的表达与肿瘤的分化、浸润、转移与预后密切相关[5]。本研究30例多形性腺瘤石蜡切片E-Cadherein免疫组化染色中, 4例(13.3%)呈强阳性(+++ );9例(30 %)强表达(++ );6例(20 %)弱表达(+);11例(36.7 %)无表达。总体阳性率为63.3%，提示肿瘤细胞之间具有一定的同质粘附性，但是由于多形性腺瘤中具有多种成分，并非仅为上皮性组织，因此相当一部分病例表现为阴性。

　　CD44v是一种细胞表面跨膜糖蛋白粘附分子变异体，主要包括CD44v3、CD44v5、CD44v6、CD44v9等。正常情况下表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞等细胞表面,与淋巴细胞向炎症部位和粘膜相关淋巴结的归位有关[2]。CD44不同变异体与人类肿瘤的浸润和转移密切相关。目前已发现,正常大肠组织不表达或仅微弱表达CD44v3，在结肠癌组织内存在CD44v3表达并且和肿瘤的转移倾向及患者的不良预后相关。有研究认为结肠癌细胞表达CD44v3和透明质酸结合，随透明质酸经淋巴系统回吸收的过程而进入淋巴系统[6]，透明质酸再和淋巴内皮的特异性透明质酸结合受体结合[7]，从而导致结肠癌细胞和淋巴管内皮粘附，并向透明质酸浓度更高的淋巴结滚动和迁移。非小细胞肺癌患者中低分化CD44v3、CD44v6的阳性表达率显著高于高分化和中分化，有淋巴结转移的肺癌患者CD44v3、CD44v6阳性表达率显著高于无淋巴结转移，TMN分期中III期显著高于I期和II期[8]。 CD44v6在乳腺癌中的表达与乳腺癌的发生发展、浸润转移和预后密切相关[9]。骨肉瘤中CD44、CD44v3、CD44v6阳性表达率明显高于骨软骨瘤;骨肉瘤中CD44v6阳性表达率明显高于CD44、CD44v3且与临床病理类型无关、与预后无关[10]。肺腺癌细胞A549的侵袭能力和粘附分子CD44v3的关系。shRNA干扰CD44v3分子表达使A549细胞的CD44v3表达降低时其侵袭能力受到抑制[11]，提示CD44v3可能与某些肿瘤的浸润和侵袭能力成正相关。本研究结果显示正常涎腺组织中CD44v6呈阳性染色，主要为肌上皮与导管上皮，染色位于细胞膜上，而腺泡上皮表达为阴性。涎腺多形性腺瘤中CD44v6呈阳性染色, 强阳性率86.7% (26/30)，肿瘤细胞团周缘CD44v6表达较强，瘤细胞团中央则表达较低，说明瘤细胞间粘附力强，不易从原发灶粘附而发生远处转移，因此PA虽为临界性肿瘤、包膜不完整，但其很少发生远处转移。CD44v3在涎腺多形性腺瘤中的表达较CD44v6低，是否由于CD44v3高表达促进瘤细胞的浸润和侵袭，有待结合临床资料进一步分析。

　　本研究检测了E-Cad及CD44v3、CD44v6在涎腺多形性腺瘤中的表达,为研究涎腺多形性腺瘤复发、转移的机制提供了一定的实验依据。今后的工作将围绕临床病例特征深入探索细胞表面糖蛋白在PA恶性转化中的意义。

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