PIN1反义核酸对乳腺癌MCF7细胞增殖及周期的影响

　　作者：周金华　　作者单位：武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心

　　【摘要】 目的 本研究利用PIN1反义核酸阻断乳腺癌MCF7细胞中PIN1表达，观察其对增殖及周期的影响。方法 构建PIN1反义核酸真核表达质粒pPIN1as，用脂质体转染法将重组质粒转染MCF7细胞，G418筛选稳定表达重组质粒的克隆，RTPCR检测PIN1基因表达水平，Western blot检测PIN1蛋白的表达，MTT检测细胞增殖状况，流式细胞术检测细胞周期。结果 稳定表达PIN1反义核酸的MCF7细胞内PIN1基因表达在mRNA水平和蛋白水平都显著降低;MTT实验显示MCF7PINas细胞的增殖速度较MCF7细胞明显减慢(P<0.05)，但FCM显示MCF7PINas细胞和MCF7细胞的周期分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论 阻断PIN1可以显著抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖活性，提示PIN1可能成为乳腺癌基因治疗的新的靶点。

　　【关键词】 PIN1，反义核酸，乳腺癌

　　PIN1(PeptidylProlyl Cis/Trans Isomerase,NIMAinterating,1)是一种肽脯氨酰顺反异构酶，能够特异性地识别磷酸化后的丝/苏脯氨酰基序，使蛋白质发生顺反异构反应，从而调节蛋白的功能，这种磷酸化后的顺反调节机制在细胞增殖和分化等许多细胞进程的调控中起了关键性的作用[1]。近年来发现PIN1在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、宫颈癌等许多肿瘤中高表达[24]。因此，有学者认为PIN1可能成为癌症治疗的新靶点[3]。本文应用反义核酸技术，构建了携带PIN1反义核酸的真核表达载体pPINas，转染乳腺癌MCF7细胞，观察细胞的增殖活性和细胞周期改变情况，探讨PIN1反义核酸用于乳腺癌基因治疗的可能性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　MCF7细胞株购自ATCC并由本实验常规保存，真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司。各种限制性内切酶购自大连宝生物公司，脂质体转染试剂Lipofectamine2000为Invitrogen公司产品,T4DNA连接酶及Trizol试剂、鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)、耐热DNA聚合酶(Taq酶)均购自Promega公司。兔抗人PIN1多克隆抗体购自Santa Cruz公司。G418购自Sigma公司。所有引物均用Oligo软件自行设计。 PCR引物合成及DNA测序由上海英骏生物技术公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养和PIN1反义核酸真核表达质粒的构建 收获对数生长期的MCF7乳腺癌细胞，Trizol一步法提取细胞总RNA，逆转录反应获得cDNA。从Genbank获得PIN1 mRNA全长及编码区序列(Accession No. NM_006221)，设计扩增反义基因的引物：上游：5′GCTCTAGACTGCGGCAGGAGGGAAGATG3′, 下游：5′CGGGATCCTCAGTGCGGAGGATGATGTG3′，下划线分别为XbaI和BamHI的酶切位点，PCR产物长度为513bp。纯化后的PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒分别用XbaI和BamHI双酶切，玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收，室温下连接3h，连接产物转化感受态细胞，铺板挑取阳性克隆，命名为pPIN1as，经酶切鉴定片断大小无误，送测序结果显示插入片断完全正确。

　　1.2.2 表达重组质粒的MCF7细胞亚克隆的筛选及鉴定 采用Lipofectamine2000脂质体转染法, 将重组质粒pPIN1as和pcDNA3.1分别转染MCF7细胞。G418筛选阳性克隆，用套环法挑取单克隆行扩大培养。鉴定阳性克隆方法为RTPCR检测细胞中的Neo基因表达。Neo基因检测引物序列：上游：5′AGAGGCTATTCGGCTATG AC3′，下游：5′GCTTCAGTGACAACGTCGAG3′。PCR产物长度为211bp，表达反义重组质粒的阳性克隆命名为MCF7PIN1as，转染空载体的阳性克隆命名为MCF7pcDNA。

　　1.2.3 RTPCR检测PIN1 mRNA表达 用于PIN1基因表达检测的引物：上游：5′TCAGGCCGAGTGTACTAC3′，下游：5′CGGAGGATGATGTGGATG3′。产物长度为428bp，同时以GAPDH作为对照。用图像扫描分析系统HPIAS1000测定各条带光密度值(AOD)，计算PIN1与GAPDH之比。

　　1.2.4 Western blot检测PIN1蛋白的表达 收集分组处理的细胞，裂解细胞提取总蛋白并蛋白定量，取100μg蛋白质样品经电泳，转膜，封闭， 依次与PIN1一抗、二抗反应，用ECL增强化学发光显色系统显色。测定各条带灰度值，计算PIN1与βactin之比，比较三组细胞中PIN1蛋白表达。

　　1.2.5 MTT检测筛选后细胞和正常细胞生长曲线 制备分组处理的单细胞悬液，按3×103/孔的细胞密度分批接种于96孔板中，以细胞开始贴壁生长定为0h，培养24、48、72、96、120h后分别往每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4h后平板离心，弃培养液，每孔加入150μl DMSO轻摇15min溶解甲臜结晶，酶标仪测定各孔570nm处吸光度值[5]。每组设4个复孔，计算同组处理样品A570平均值，绘制细胞生长曲线。

　　1.2.6 流式细胞术检测细胞周期分布 收获细胞，PBS洗一遍后用75%乙醇固定并置20℃过夜，常规PI染色，流式细胞仪检测细胞周期。

　　1.2.7 统计学分析 所有数据均用±s表示，精确到两位小数，应用SPSS12.0版统计软件进行t检验和方差分析。

　　2 结果

　　2.1 反义基因真核表达质粒的酶切和鉴定

　　以MCF7细胞的cDNA为模板，利用5′端含有XbaI和BamHI的引物扩增出长度为513bp的PIN1 cDNA片断，酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1上，转化DH5α宿主菌，得到阳性克隆。pcDNA3.1和pPINas分别经XbaI和BamHI双酶切后行电泳，pPINas酶切电泳后在5 366bp和503bp处分别可见载体片断和插入的PIN1的反义核酸片断，见图1。测序结果显示定向插入序列完全正确，表明成功构建了pPIN1as反义重组质粒。

　　2.2 PIN1反义重组质粒及空质粒转染阳性细胞亚克隆的筛选、鉴定

　　用脂质体法将反义重组质粒和对照空质粒分别转染MCF7细胞，含G418的完全培养基培养直到挑出阳性克隆，反义重组质粒组和空白质粒组的阳性克隆中均检测出较高的Neo基因表达，而正常MCF7细胞中则无Neo基因表达，见图1，说明成功筛选出稳定表达重组质粒的MCF7细胞亚克隆。

　　2.3 转染反义重组质粒对MCF7细胞PIN1基因表达的影响

　　RTPCR和Western blot分别用于检测mRNA水平和蛋白质水平的表达。RTPCR显示转染反义质粒后PIN1 mRNA表达水平比未转染组明显下降，相对积分吸光度值显示下降了64.7%;Western blot显示转染反义质粒后PIN1 蛋白质表达水平也比未转染组显著下降，相对积分吸光度值显示下降了57%，而转染空质粒组PIN1表达在mRNA水平和蛋白水平与未转染组差异均无统计学意义，见图2。

　　2.4 转染反义重组质粒对MCF7细胞增殖的影响

　　MTT法测定结果显示，转染反义质粒组MCF7细胞增殖速度明显减慢，与未转染组比较差异有统计学意义，转染空质粒组与未转染组相比差异无统计学意义。结果证明，PIN1表达水平的下降可以导致细胞增殖速度明显减慢，见图3。

　　2.5 转染反义重组质粒对MCF7细胞周期的影响结果显示：转染反义质粒组、转染空质粒组、未转染组三组细胞细胞周期分布无明显差异。

　　3 讨论

　　依赖PIN1催化的丝/苏-脯氨酰顺反异构转变是新发现的蛋白磷酸化后信号转导机制，在G2/M期转换、G1/S期转换、M期进程和G0期进入G1期等细胞周期事件中发挥重要作用[611]。在多种致癌信号通路中，众多癌信号分子含有共同的丝/苏-脯氨酰基序，其磷酸化后被激活，但活性很低且不稳定易降解。PIN1可特异地识别该磷酸化的丝/苏-脯氨酰并催化构型转变，使该类蛋白被充分激活且不被降解，故PIN1可加强和放大多种致癌信号，被称为肿瘤发生发展的催化分子。另一方面，PIN1本身的表达水平和功能活性也可以在致癌通路得以上调。例如在Neu/Ras介导的乳腺上皮细胞的转化和乳腺肿瘤发生中，PIN1是E2F的一个靶基因，同时，PIN1又能促进Rb的磷酸化和E2F的释放 [6,11]。

　　本文应用反义核酸技术，成功构建了PIN1反义核酸的真核表达载体，利用阳离子脂质体介导将其转染MCF7细胞并筛选出稳定表达PIN1反义核酸的MCF7细胞亚克隆，用于探讨PIN1反义核酸用于治疗乳腺癌的可能性，同时为进一步研究PIN1在乳腺癌中的作用奠定实验基础。

　　结果显示，PIN1反义核酸可显著下调MCF7细胞中PIN1的表达，并明显抑制MCF7细胞的增殖。我们在进行稳定筛选时，从未转染MCF7细胞全部死亡后到挑出稳定表达PIN1反义核酸的细胞克隆延长到3.5周。细胞增殖受到抑制可能与以下原因有关：(1)由于PIN1功能被阻断，在肿瘤细胞中致癌信号不能产生级联放大作用，致癌通路被阻断，有助于恢复细胞内信号稳态，逆转肿瘤细胞的恶性表型，趋向于恢复正常表型; (2)阻断PIN1功能造成MCF7PINas细胞各个周期运行的缺陷，延长了细胞周期时间[12]，使相同时间内细胞增殖数量降低。

　　尽管MCF7PIN1AS细胞的增殖速度明显减慢，但我们用流式细胞仪检测显示：与正常MCF7细胞相比，MCF7PIN1AS细胞周期分布没有明显改变，与文献报道一致[12]。分析可能与下列因素有关：(1)细胞内仍有较低水平的PIN1表达; (2)某些与PIN1同一家族的蛋白如Par14可能部分代偿PIN1的功能，由于PIN1的降低使细胞周期运行出现多位点缺陷，但又不足以造成完全阻滞，使得细胞周期各时相按比例延长，而那些未及代偿的细胞在转染后数天或在稳定筛选过程中，已发生凋亡。同时有文献报道：抑制PIN1基因可引起细胞M期阻滞和诱导细胞凋亡[13]。PIN1对细胞周期的影响及其机制尚待进一步研究。

　　我们的研究结果表明，利用PIN1反义核酸可以显著地抑制乳腺癌细胞MCF7的增殖，因此，PIN1有可能成为乳腺癌基因治疗的新靶点。

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