肿瘤相关抗原在人大肠癌中的表达

　　作者：冯慧， 伊德林， 曾艳，刘芙蓉，方瑾 ，宋今丹 作者单位：110034 沈阳医学院生物化学教研室;

　　【摘要】 目的 应用ND1单抗和抗CEA单抗对大肠癌细胞的标记情况对比，探讨LEA在大肠癌中的表达及意义。方法 采用流式细胞仪和免疫细胞化学染色检测大肠癌细胞系LEA和CEA的表达。并采用间接ELISA法测定LEA和CEA单抗对大肠癌细胞系的特异性。应用免疫组化检测其在大肠癌组织中的表达。结果 流式细胞仪检测显示，LEA抗原在CCL187、CX1、CLone A和CCL229细胞表达的阳性峰平均荧光强度呈递减趋势，并且强于CEA的表达量(P<0.01)。LEA在高分化大肠癌细胞系CCL187和CX1高度表达，并且低侵袭大肠癌细胞系CCL187和CX1 LEA表达量高于高侵袭大肠癌细胞系CLone A和CCL229(P<0.01)。ELISA检测表明，与抗CEA单抗相比，ND1单抗对大肠癌细胞具有很强的特异性结合力(P<0.01)。LEA的表达阳性率随大肠腺癌组织分化程度降低而下降(P<0.01)，而且对高分化腺癌表现出更高的选择性。抗CEA单抗对高、中、低分化癌选择性相似(P>0.05)。结论 LEA是更加特异的高分化大肠癌相关抗原。LEA可能与癌细胞的分化程度、侵袭力、恶性程度有关， LEA可作为早期诊断和判断大肠癌恶性程度的有用指标。

　　【关键词】 肿瘤相关抗原;大肠癌细胞; 表达

　　Expression of Tumorassociated Antigen in Colorectal Carcinoma

　　FENG Hui, YI Delin, ZENG Yan, LIU Furong, FANG Jin，SONG Jindan

　　Department of Biochemistry，Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China;Key Laboratory of Cell Biology, Ministry of Public Health of China, China Medical University

　　Abstract：Objective This study was designed to evaluate the expression and its significance of colorectal carcinomaassociated antigen LEA in colorectal carcinoma cells through the comparison of a new monoclonal antibody (ND1) and antiCEA monoclonal antibody.Methods Expression of LEA and CEA in colorectal carcinoma cells was detected with immunocytochemistry and flow cytometry . The specificity of LEA and CEA in colorectal cancercells was analyzed by ELISA, and to detect the expression of LEA in colorectal cancer tissues with immunohistochemical method.Results Flow cytometry detection showed that positive peak mean fluorescence intensity was gradually decreasing in the expression of LEA in CCL187,CX1,CLoneA and CCL229,and stronger than that of CEA(P<0.01). LEA was highly expressed in the well differentiated colorectal cancer cells of CCL187 and CX1,and its expression amount in low invasive cell lines of CCL187 and CX1 was higher than high invasive ones of CLoneA and CCL229(P<0.01).ELISA analysis revealed that monoclonal antibody ND1 had stronger specific binding activity to the colorectal carcinoma cell lines as compared to the CEA(P<0.01).The expression of LEA was decreased following the drop of tumor differentiation degree(P<0.01)and exhibited higher selectivity in well differentiated colorectal cancer(P<0.01).CEA had similar selectivity in well, moderately,and poorly differentiated colorectal cancer(P>0.05).Conclusion LEA is more specific well differentiation colorectal carcinomaassociated antigen. LEA may be related to the differentiation degree, invasiveness and malignancy degree of cancer cells. LEA can be used as a useful measurement for the early diagnosis and malignancy degree of colorectal carcinoma.

　　Key words：Tumorassociated antigen; Colorectal cancer cells; Expression

　　0 引言

　　大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。其发生是一个以原癌基因激活和抑癌基因失活为基础的多步骤、多阶段的过程。目前，晚期大肠癌的5年生存率并无多大改观[1]。提高大肠癌治愈率的关键在于早发现、早诊断、早治疗。因此寻找理想的特异性强、敏感性高的肿瘤相关抗原是提高防治的重要手段之一。CEA(Carcinoembryonic antigen ，CEA)是最早发现的大肠癌血清肿瘤标志物，即癌胚抗原[2]，分子量约为180kD的糖蛋白，编码基因位于19号染色体，CEA在大多数恶性肿瘤血清中均有不同程度升高，特异性较低，对大肠癌的早期诊断价值不高。1986年宋今丹教授在美国哈佛大学进行合作研究期间，用人大肠癌细胞系CCL187作为免疫原，将获得的单克隆抗体命名为ND1，将其所识别的大肠癌细胞表面肿瘤相关抗原命名为LEA(Large External Antigen, LEA) [3]。生物学特性研究表明，LEA是一种大分子量的可溶性大肠癌相关抗原，位于细胞表面的细胞膜，分子量大于500kD，属糖蛋白。本研究应用抗人大肠癌单克隆抗体ND1与抗CEA单抗在大肠癌细胞表面的标记情况作比较，进一步证明抗人大肠癌细胞膜表面抗原(LEA)的单克隆抗体(ND1)有很高的特异性，为应用此抗体进行大肠癌临床病理辅助诊断、血清学检测和导向治疗等提供重要的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 动物与细胞 Balb/c纯系小鼠由本校实验动物部提供，动物合格证号：省动字01110，分泌抗人大肠癌mAb ND1的鼠杂交瘤细胞株IC2由宋今丹研制建株，人大肠癌细胞系CCL187、CX1、CCL229和CLone A均由美国哈佛大学医学院DanaFarber肿瘤研究所惠赠，人宫颈癌细胞系HeLa由哈佛大学赠送。

　　1.1.2 试剂与仪器 RPMI1640、DMEM培养基为Sigma公司产品,抗LEA单克隆抗体由本室研制;降植烷为Sigma公司产品;FITC标记羊抗小鼠IgG单克隆抗体为Sigma公司产品;抗CEA单抗、SP试剂盒购自ZYMED公司;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Jackson公司;TMB购自Boehringer Mannheim公司。Sorvall RC28S,Du Pont超速离心机;Pharmacia HiTrap protein G 柱;Becton Dickinson流式细胞仪;LABSYSTEMS酶标仪。

　　1.1.3 标本来源 本研究所用石蜡包埋组织标本选自中国医科大学第二附属医院普外科大肠癌患者标本及结肠镜活检标本共238例，并经HE染色病理证实，其中大肠癌170例，按“全国大肠癌病理学研究统一规范”组织学分类标准，其中高分化癌48例，中分化癌65例，低分化癌27例，粘液腺癌24例,印戒细胞癌6例;大肠非癌组织68例作为对照观察，其中大肠腺瘤41例，正常大肠粘膜27例。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 单克隆抗体的制备、纯化与鉴定 按常规方法用降植烷免疫出生6～8周龄的Balb/c纯系雌鼠,7～12d后腹腔注射杂交瘤细胞株IC2，收集腹水4℃离心，上清4℃透析1～2d。经0.22μm滤膜过滤后注入HiTrap protein G柱(柱床体积5ml)纯化。Lowry法测定纯化前后的抗体蛋白浓度。SDSPAGE 测定ND1单克隆抗体纯度。

　　1.2.2 间接免疫荧光法检测抗体活性 取对数生长期的人大肠癌细胞CCl187和人宫颈癌上皮细胞HeLa分别传代于盖片上，37℃培养2～3d后，以被检样品ND1单抗和抗CEA单抗为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG荧光抗体为二抗，37℃下暗处作用30min。PBS冲洗后，在荧光显微镜下观察。PBS为第一抗体作阴性对照。

　　1.2.3 间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体生物活性、效价测定及特异性 取对数生长期的CCL187和HeLa细胞，以2～5×105/ml、100μl/孔，培养24～48h，以PBS洗板1次。0.05%戊二醛 4℃ 固定15min。PBS洗3次。1%BSAPBS 4℃封闭过夜。PBS涮洗后每孔加等摩尔ND1单抗和抗CEA单抗50μl/ 孔，室温孵育1h，PBS洗3次。加二抗辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 50μl /孔，室温孵育1h。PBS洗3次后加底物TMB 100μl/孔，暗处反应15min，加2mol/L H2SO4 50μl/孔，终止反应。在酶标仪上于波长450nm 测定吸收值。同时设空白对照及以PBS代替第一抗体作阴性对照。

　　1.2.4 LEA和CEA抗原在大肠癌细胞的表达

　　1.2.4.1 免疫细胞化学染色观察 按试剂盒说明(SP法)进行操作。CCL187和HeLa细胞作为抗原对照，利用PBS代替第一抗体作阴性对照。取对数生长期的细胞，分别接种于盖片，于37℃培养48h，4%多聚甲醛4℃固定30min，PBS洗3次，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶10min，PBS洗3次， 10%正常羊血清阻断非特异性反应15min，滴加第一抗体ND1和抗CEA单抗50μl，湿盒中37℃孵育1h，PBS洗3次，滴加生物素标记的第二抗体50μl ，37℃孵育15min，PBS洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素50μl ，37℃孵育15min，PBS洗3次，100μl DAB显色3～10min，苏木素复染5min，酒精系列脱水，二甲苯透明 ，中性树胶封片后镜下观察。

　　1.2.4.2 流式细胞仪检测 将CCL187、CX1、CCL229和CLone A每种细胞分成3组，分别检测LEA与CEA抗原，第3组以PBS代替一抗作阴性对照。将上述对数生长期的细胞，消化后制成单细胞悬液，PBS(含1%BSA)洗3次，多聚甲醛固定1h，PBS洗3次，调整细胞浓度至1×107/ml, BSA 30min，封闭非特异位点，取每种细胞悬液100μl，分别加ND1单抗，抗CEA单抗、PBS 50μl ， 置4℃，45min，1 500 r/min离心5 min， PBS洗3次，重悬于100μl PBS,避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG， 置4℃，45 min。1 500r/min离心5 min，PBS洗3次，重悬于1.0ml PBS中，在激发波长为488nm下上FACSort测定5 000～10 000个细胞的平均荧光强度，采用CellQuest 分析软件分析抗原表达量。用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.2.4.3 免疫组织化学染色 采用SP法进行染色，每批染色严格注意条件相同，并设对照。阴性对照以PBS替代一抗，已知LEA和CEA阳性的大肠癌组织作阳性对照。结果判定：光镜下观察有棕黄色颗粒出现在细胞膜、细胞浆、腺腔及细胞外粘液中为阳性反应。阳性细胞数占视野10%以上为阳性标准。

　　1.3 统计学处理

　　所有资料上机采用SPSS10.0软件包对数据进行统计学分析。对计量资料，数据以±s表示，用方差分析进行统计学检验;计数资料，实验数据采用χ2检验进行统计学分析。

　　2 结果

　　2.1 单克隆抗体ND1的活性及纯度鉴定

　　间接免疫荧光法检测各洗脱峰结果表明，只有第二峰收集液的ND1抗体阳性，且纯化后的抗体活性良好。SDSPAGE分析显示，第二峰为IgG的单一组分，在Mr55 000和Mr25 000处显示为均一的两条带，分别为LgG的重链和轻链。纯度较好。间接ELISA结果表明ND1抗体纯化后浓度为1mg/ml时，抗体效价为1∶10 000。

　　2.2 LEA、CEA抗体特异性检测

　　ND1单抗与CCL187细胞表面抗原结合，整个细胞膜均显示黄绿色荧光，呈一光环。细胞内及背景不发光，见图1。LEA主要分布在CCL187细胞膜表面，在细胞表面的某些区域还有高度亮的荧光聚集。ND1单抗对非大肠癌HeLa细胞表面未显示荧光。CEA在CCL187细胞表面呈弱阳性，在细胞表面少量表达，呈现分散颗粒状均匀分布。ELISA 定量检测表明ND1单抗与CCL187细胞的结合性高于同HeLa细胞，其差异有统计学意义(P<0.01)，而抗CEA单抗与CCL187和HeLa细胞结合性差异显著(P<0.05)，与抗CEA单抗相比，ND1单抗对大肠癌细胞具有很强的特异性结合力(P<0.01)。

　　2.3 免疫细胞化学染色

　　LEA在CCL187细胞内呈强阳性反应，细胞内有大量浓染的棕色成团区，细胞膜尤为明显，见图2。CEA在CCL187细胞内呈弱阳性反应，细胞内有散在的棕黄色淡染区。LEA 在HeLa细胞内呈阴性反应，无棕黄色区域。而CEA呈弱阳性反应。

　　2.4 FACS检测大肠癌细胞系表面LEA、CEA抗原的表达

　　4种细胞CCL187、CX1、CLone A和CCL229 LEA的平均荧光强度分别为2 832.45±38.63、932.83±18.17、366.52±31.24、201.07±13.41,有明显差异(P<0.01), 呈递减趋势，LEA可被证明为细胞膜表面抗原，在4种高分化大肠癌细胞系CCL187、CX1、CLone A和CCL229高度表达且表达量不同(P<0.01),见图3，这与先前结论一致[3]。而CEA的平均荧光强度分别为35.12±6.38、23.68±4.47、0.49±0.02、0.28±0.05,CEA主要为CCL187和CX1细胞表面抗原。可见，在这4种大肠癌细胞系中LEA的表达量高于CEA(P<0.01)。

　　2.5 免疫组织化学染色

　　2.5.1 LEA与CEA在大肠癌、大肠腺瘤及正常粘膜中的表达 LEA与CEA的表达主要位于癌细胞腺腔侧的细胞膜表面、腺腔内粘液分泌物和细胞外的粘液中，细胞浆弥漫性分布淡染，见图4。LEA在大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠粘膜的阳性表达率分别为84.1%(143/170)(其中高分化腺癌100%、中分化腺癌83.1%、低分化腺癌51.8%)、75.6%(31/41)和14.8%(4/27)。CEA在大肠癌、大肠腺瘤和正常大肠粘膜的阳性表达率分别为88.8%(151/170)(其中高分化腺癌93.8%、中分化腺癌92.3%、低分化腺癌70.4%)、82.9%(34/41)和40.7%(11/27)。LEA的阳性表达率随大肠腺癌组织分化程度降低而下降(χ2=28.21, P<0.01)，而且对高分化腺癌表现出更高的选择性。抗CEA单抗对高、中、低分化癌选择性相似(P>0.05)。LEA在大肠癌阳性表达率与正常粘膜相比差异极显著(χ2=59.08，P<0.01),而与大肠腺瘤相比差异无统计学意义(χ2=1.65，P>0.05)。LEA在腺瘤中的阳性表达率，明显高于正常粘膜(χ2=24.09, P<0.01)。与CEA相比,LEA在大肠癌与大肠腺瘤组织的阳性表达率略低，但无统计学差异(χ2=2.26, P>0.05)。

　　2.5.2 LEA与CEA表达的关系 LEA与CEA的阳性表达在高分化大肠癌组织之间呈显著正相关(χ2=2.93, P>0.05),在中分化大肠癌中两者相关性也非常明显(χ2=2.57, P>0.05), 在低分化大肠癌中也很明显(χ2=1.95, P>0.05),在大肠腺瘤中表达迹无差异(χ2=0.31, P>0.05),但在大肠正常粘膜中，LEA与CEA的表达呈显著负相关 (χ2=4.52,P<0.05)。

　　2.5.3 LEA与CEA在大肠癌诊断中的价值 单独应用LEA与CEA的灵敏度分别为84.1、88.8，特异度分别为48.5、33.8，阳性预测值分别为80.3、77.0，阴性预测值分别为55.0、54.8;平行试验与系列试验的灵敏度分别为95.3、77.6，特异度分别为23.5、55.9，阳性预测值分别为75.7、81.5，阴性预测值分别为66.7、50.0。

　　3 讨论

　　肿瘤标志物是由肿瘤细胞生物合成、释放或者是宿主对癌类反应性的一类物质。这种抗原一般仍保持原来细胞的抗原性。在正常细胞不表达或有微量表达，但在肿瘤发生时其含量要明显高出良性肿瘤或正常组织[2]。在这些与肿瘤相关的抗原中很多被作为临床血清肿瘤标志使用[4]。同样,肿瘤标志物也可作为组织或细胞标志物，用免疫化学研究标志物适用于诊断肿瘤或判断肿瘤的预后[5]。CEA是目前应用最广泛的肿瘤标志物。许多上皮性肿瘤均有CEA的表达，同时一些正常上皮细胞亦有CEA表达[6]，因此用于肿瘤的诊断意义不大，但在疗效监测和评估预后中更有意义。ND1抗体经Protein G 柱纯化后，收集活性抗体峰，经间接免疫荧光和ELISA检测其抗原特异性，此单抗能识别大肠癌细胞的表面抗原，证明此抗体与人大肠癌细胞系CCL187具有特异性结合力，而不与HeLa细胞结合;与CEA单抗相比，ND1单抗与CCL187细胞的结合力差异具有统计学意义，说明LEA抗原是一种区别于CEA等其他大肠肿瘤相关抗原，在大肠癌细胞表达更强，这与以前报道相符[3]，同时进一步证明了ND1单抗是高效价、高特异性、高亲和力的抗大肠癌细胞系表面抗原LEA的单克隆抗体。免疫细胞化学染色同样证明ND1抗体能特异地识别大肠癌细胞中的抗原，LEA是比CEA更特异的大肠癌细胞表面相关抗原。本研究中LEA的阳性表达率越低，细胞的分化程度越低，肿瘤的恶性度越高。在高分化大肠癌的阳性表达率高达100%。这与癌细胞分化程度越差抗原性越低有关。表明LEA可能是肿瘤分化的标志。而抗CEA单抗对高、中分化癌的选择性相同，它不受肿瘤分化程度的影响，即使是低分化腺癌亦可呈阳性反应。因此，CEA不能用作良、恶性上皮性肿瘤的鉴别诊断。

　　A组：LEA和CEA在CLoneA细胞的表达;B组：LEA和CEA在CX1细胞的表达;C组：LEA和CEA在CCL187细胞的表达;D组：LEA和CEA在CCL229细胞的表达

　　图3 流式细胞仪间接免疫荧光法测定LEA与CEA抗原在大肠癌细胞系的表达(略)

　　LEA和CEA在大肠癌、大肠腺瘤与正常大肠粘膜中的标记结果显示，LEA和CEA在正常大肠粘膜、腺瘤、大肠癌组织中的阳性率呈递增趋势，腺瘤和大肠癌组织中LEA的阳性表达率与正常粘膜相比有极显著差别。LEA与CEA在大肠癌、大肠腺瘤中的阳性表达率显著高于正常粘膜，可以认为LEA和CEA的高表达与大肠腺瘤和大肠癌的发生发展均有关，大肠腺瘤在恶变过程中可产生和大肠癌相同的肿瘤相关抗原，可能是大肠癌细胞旁分泌作用的结果，与大肠癌的局部浸润和术后复发有重要关系。据报道，在大肠癌中平均只有14.2%～15.5%的病灶中可见到残留的腺瘤组织，且随着癌的浸润发展和肿瘤直径增大，原来存在的腺瘤组织被进一步侵蚀破坏 [7]，所以大肠腺瘤性息肉是大腺癌的癌前病变，大肠癌大多是由大肠腺瘤恶变形成的。从腺瘤发展为癌的时间大约是7～10年[8]。早期发现并及时治疗大肠腺瘤是防止和减少大肠癌发生的理想途径。

　　本试验中 LEA与CEA在大肠癌、大肠腺瘤中均呈高表达，且两者有明显的相关性，而在大肠正常粘膜中两者表达不相关，因此虽然LEA是有别于CEA的一种新的高分化大肠癌相关抗原，在诊断大肠癌方面两种方法一致。由于肿瘤相关抗原的不均一性，任何一株单抗只能检出部分病例，组合几株单抗才能提高其敏感性[8]。临床上常将几项相关的标志物组成联合标志物组，提高诊断的准确性。单独应用LEA与CEA的灵敏度相似，LEA特异度明显高于CEA 。LEA和CEA在联合检测中采用系列试验虽然提高了特异度和阳性预测值，但假阴性率增高;采用平行试验虽然可提高敏感度、提高阴性预测值，但假阳性率增高。因此联合应用两种单抗的筛检方案价值不大。

　　大肠癌细胞的恶性表型与其分化程度密切相关。一般认为高分化癌细胞侵袭力低，低分化癌细胞侵袭力强，增殖力高，肿瘤的恶性程度高。从流式细胞仪测定结果中发现，LEA在高分化大肠癌细胞CCL187、CX1、CLone A和CCL229表面表达量均高于CEA(P<0.01)。在低侵袭力大肠癌细胞CX1和CCL187中LEA的表达量均高于高侵袭力大肠癌细胞CLone A和CCL229(P<0.01)，这与组织中检测的结果一致。这个结果提示，LEA可能与细胞分化程度、癌细胞的侵袭力、恶性程度有关，LEA是更加特异的高分化大肠癌相关抗原。LEA可能是一种很有潜力的肿瘤标志物，在大肠癌导向诊断和治疗中，应用ND1单抗可能要比CEA单抗效果好。目前，LEA的血清学诊断方法已经建立[9]。以ND1单抗重组构建的基因工程单链抗体ND1scFV亦显示了良好的体内外特异结合活性 [10]。对此抗原的进一步研究，对指导临床早期辅助诊断和治疗、判断肿瘤恶性程度等有望提供新的途径和方法。

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