绒毛膜癌的基因表达谱初步研究

　　作者：李学农 作者单位：510515广州，第一军医大学病理学教研室

　　【摘要】 目的 比较绒毛膜癌与葡萄胎基因表达谱改变, 研究绒毛膜癌的基因表达特征。方法 采用cDNA芯片技术,用Cy3dUTP标记葡萄胎mRNA, 用Cy5dUTP标记绒毛膜癌细胞mRNA制备探针进行芯片杂交, 抽取3条基因作RTPCR验证。结果 从有效基因位点中筛选出227个差异表达基因，占所研究基因的5.66%, 其中上调基因表达共85条，占2.12%, 下调基因共142条，占3.54%。结论 与葡萄胎相比, 绒毛膜癌能引起包括信号转导相关基因、转移相关基因等较广泛的基因激活与上调效应，同时也下调了细胞周期负性调节、蛋白酶抑制因子等相关基因，初步揭示了绒毛膜癌基因调控异常的复杂性。

　　【关键词】 绒毛膜癌 葡萄胎 基因表达谱

　　绒毛膜癌是一种较常见的滋养细胞恶性肿瘤，其多数发生于葡萄胎之后，绒毛膜癌与葡萄胎同属于滋养细胞疾病，但却具有鲜明不同的侵袭转移生物学特性，即良性葡萄胎无侵袭力和转移力, 而绒毛膜癌则具有极强的侵袭力及转移力[1]。有关绒毛膜癌与葡萄胎的基因表达谱比较研究尚未见国内外文献报道。我们利用基因芯片技术，试图探讨滋养细胞恶性肿瘤基因表达谱特点，为寻找绒毛膜癌分子诊断与治疗基因靶标及筛选转移相关基因提供线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Trizol购自Gibco, AMV Reverse Transcriptase，Oligo(dT)，dNTP，Taq，Agarose均为PROMEGA产品，胰蛋白酶，Cy3dUTP，Cy5dUTP为Amersham Phamacia产品。Oligotex mRNA Midi Kit 购自Qiagen。DEPC, EB(Ethidium Bromide)，SDS购自Sigma, 其余试剂采用国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织样本及RNA提取

　　绒癌细胞标本为常规培养的人绒癌细胞系JEG3，完全性葡萄胎标本取自南方医院妇产科, 总RNA提取及mRNA纯化按常规方法, 并进行热稳定试验。

　　1.2.2 芯片与探针制备

　　靶基因PCR反应及产物纯化均采用标准化方法[2，3], Cartesian点样仪在硅烷化玻片(Corning)上点样。在50μl逆转录反应体系中加入3μl RNA，参照Schena等[4]的方法逆转录合成cDNA，用Cy3dUTP标记葡萄胎(对照组)mRNA，用Cy5dUTP标记绒毛膜癌 (实验组)的mRNA, 乙醇沉淀后将两种探针等量混合、避光、真空抽干至50μl，溶解于20μl 5×SSC+0.2%SDS杂交液中。

　　1.2.3 芯片杂交

　　将基因芯片和杂交探针分别在95℃水浴中变性5min,并置于杂交舱内，加入混合探针, 用杂交密封舱加以封闭，置于60℃杂交箱。杂交15～20h[4，5]。然后揭开盖玻片,分别用洗片试剂1(2×SSC+0.2%SDS), 洗片试剂2(0.1×SSC+0.2%SDS), 洗片试剂3(0.1×SSC)洗涤10min,室温晾干。

　　1.2.4 检测与分析

　　ScanArray芯片扫描仪扫描芯片, Imagene3.0分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值。差异表达基因结果判断标准: Cy5/Cy3>2.5或<0.25;Cy3、Cy5之一的荧光信号值>200。

　　1.2.5 RTPCR验证

　　按常规方法，PCR循环参数: 94℃60～90s、56℃60～90s、72℃90～120s，循环35次后72℃7min，同时扩增待检基因及βactin基因片段。设阴性对照将DNA模板改为DEPCtreated水。用Bandleader3.0软件分析PCR产物条带密度。基因表达值以(目的基因密度值/βactin基因密度值)×100% 表示。

　　2 结果

　　2.1 基因芯片扫描结果

　　实验组Cy5荧光标记扫描图和对照组Cy3荧光标记扫描图背景较低，阳性位点较清晰、规整。实验组、对照组(Cy5/Cy3)荧光标记扫描(图略)。

　　2.2 差异表达基因筛选结果

　　按严格筛选标准，绒毛膜癌细胞基因表达上调的有85条，基因表达下调的有142条。

　　2.3 RTPCR结果

　　Bandlead3.0分析差异表达基因CAMK4、p130、TRAMP各组基因表达值(平均相对密度值) 与基因芯片结果一致。

　　3 讨论

　　基因芯片技术具有高通量、高度并行性、高敏感性以及微型化、自动化的显著优势，已成为后基因组时代的关键技术平台[6，7]。本实验采用目前较成熟且应用最广泛的cDNA芯片技术，其稳定性、可靠性及可重复性已被许多研究者所证实[48]。按严格筛选标准，本研究共筛选出227个具有显著差异表达基因，占所研究基因的5.66%, 其中上调基因表达共85条，占所研究基因的2.12%, 下调基因共142条，占所研究基因的3.54%，获得了较丰富的有关绒毛膜癌细胞相关基因的信息。初步分析发现，一些差异表达基因与文献报道完全一致[911]，这从另一个方面证明了采用基因芯片技术的可靠性,同时也发现了一些可能与绒毛膜癌有关但未见报道的基因及新的未知功能基因。例如：与葡萄胎相比, 绒毛膜癌上调了human insulinlike growth factor I, human protein kinase (JNK2), human EBV induced Gprotein coupled receptor (EBI2), human heparan sulfate proteoglycan (HSPG), human MAP kinase等基因的表达。总体来说，绒毛膜癌基因表达谱主要是上调了细胞生长因子基因、细胞信号传导相关基因(包括G蛋白通路、MAP通路等的关键激酶) 、细胞周期正性调节的基因、细胞粘附基因、基因表达调节基因等。初步分析显示，这些基因具有刺激细胞生长、拮抗凋亡、促进细胞信号传导作用, 这些基因的上调表达，可能构成了绒毛膜癌细胞无限制生长和转移的物质基础。提示绒毛膜癌发生与多基因激活具有密切的联系，初步揭示了绒毛膜癌基因调控异常的复杂性。

　　在下调基因表达方面，绒毛膜癌下调了homo sapiens golgin67 (GOLGA5), homo sapiens phosphoglycerate mutase (PGAMB), homo sapiens Kunitztype protease inhibitor (kop), homo sapiens CD9 antigen (p24), homo sapiens growtharrestspecific protein (gas), ribonucleotide redutase, glucose transporter 等基因的表达。总体来说，绒毛膜癌下调基因表达作用也是多靶位的，但主要集中在细胞相关功能的负性调节因子方面。主要包括细胞周期负性调节基因、抑癌基因、蛋白酶抑制因子以及细胞代谢调节因子等。这些基因的表达下调，有利于促进有丝分裂和细胞周期进展, 维持相关细胞信号传导作用。这说明与葡萄胎相比, 绒毛膜癌存在更为复杂的基因调节异常。通过基因芯片技术, 我们初步了解了绒毛膜癌在基因表达上的复杂性(少数为未知功能基因,如MGC39325等)，这些差异表达基因在绒毛膜癌中的作用值得进一步探讨。

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