乳腺癌中TP、VEGFD、VEGFR3的表达及与淋巴管生成关系的研究

　　作者：杨淑改 王福安 李惠翔 臧卫东 作者单位：467000 河南省平顶山市卫生学校(杨淑改、王福安);郑州大学医学院(李惠翔、臧卫东)

　　【摘要】 目的 探讨乳腺癌中TP、VEGFD、VEGFR3的表达及与淋巴管密度，分析其与乳腺癌临床生物学行为及预后的关系。方法 免疫组织化学SP法检测37例乳腺癌及30例正常乳腺组织中TP、VEGFD、VEGFR3的表达及淋巴管密度。结果 乳腺癌中TP、VEGFD、VEGFR3的阳性表达高于正常乳腺组织(P<0.05);无淋巴结转移病例TP、VEGFD、VEGFR3表达阳性率及淋巴管计数均明显低于淋巴结转移组(P<0.05)：成组织学分级Ⅰ级病例TP、VEGFD、VEGFR3表达阳性率及淋巴管计数均明显低于组织学分绂Ⅱ级或Ⅲ级病例(P<0.05);TP、VEGFD、VEGFR3阳性表达组淋巴管计数均明显高于阴性表达者(P<0.01)。结论 TP、VEGFD、VEGFR3和淋巴管计数均为反映乳腺痢进展、生物学行为、转移及预后的重要标记物，乳腺癌组织中TP、VEGFD、VEGFR3表达升高与淋巴管生成和淋巴结转移及预后有关。

　　【关键词】 乳腺肿瘤;胸苷磷酸化酶;血管内皮生长因子D;血管内皮生长因子受体3;淋巴管密度;

　　淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移途径。胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)足近年来发现的细胞生长因子，TP通过血管生成作用促进癌细胞的生长和转移[1-3]。TP除促进血管生成作用外，也具有促淋巴管生成作用。血管内皮生长因子D(vascular endothelial growth factorD，VEGFD)与其受体血管内皮生长受体3(vascular endothelial growth factor receptor3,VEGFR3)相结合后促进肿瘤淋巴管生成和扩张，与淋巴结转移密切相关[4] 。D240是目前敏感性和特异性均较高的淋巴管内皮特异性标记物[5]。本研究应用SP免疫组化法检测乳腺癌和正常乳腺组织中TP、VEGFD、VEGFR3表达及D240标记的阳性淋巴管数，探讨其与乳腺癌临床生物学行、转移及预后的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本及临床病理资料 收集郑州大学一附院20042006年乳腺癌手术切除标本37例和正常乳腺组织手术切除标本30例，乳腺癌患者术前均无放疗、化疗及其他治疗史年龄31～75岁，平均年龄(50±17)岁。经病理证实，37例乳腺癌组织均为浸润性导管癌，其中年龄<50岁的23例，年龄≥50岁的14例;肿瘤直径<20 mm的10例，≥20 mm的27例;有淋巴结转移20例，无区域淋巴结转移17例;组织学分级：Ⅰ级7例，Ⅱ级22例，Ⅲ级 8例。

　　1.2 主要试剂 TP鼠抗人单克隆抗体，购自Roche公司(法国);VEGFD兔抗人多克隆抗体，购自武汉博士得公司;VEGFR3即用型多克隆抗体、D240单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司;免疫组化SP检测试剂盒、DBA显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　1.3 方法 选取乳腺癌及正常乳腺组织存档腊块，连续4 μm切片,采用免疫组织化学SP法依试剂盒提供步骤操作，阳性对照切片由试剂公司提供，以0.01 mol/LPBS代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判定 TP免疫组化信号位于细胞浆内，呈棕色或棕黄色颗粒，以免疫组化量化后数值：≤2者为阴性，>2者为阳性。VEGFD免疫组化阳性信号位于细胞浆内，呈棕色或棕黄色，以棕色或棕黄色颗粒的阳性细胞数≥10%为阳性，<10%为阴性。VEGFR3阳性表达主要位于间质细胞和肿瘤细胞胞浆内，为浅黄色至棕褐色颗粒，不着色至弱着色为阴性表达，中等着色至强着色为阳性表达。D240染色阳性标记的脉管数视为LVD，参照weidner[6]方法进行计数。

　　1.5 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 TP、VEGFD、VEGFR3表达及淋巴管计数 37例乳腺癌组织中TP、VEGFD、VEGFR3的阳性率和淋巴管计数明显高于30例正常乳腺组织中的阳性率和淋巴管计数(P<0.05)。见表1。

　　表1 乳腺癌组织和正常乳腺组织中TP、VEGFD、VEGFR3

　　表达及淋巴管计数%

　　组别TP阳性

　　率(﹪)VEGFD阳性

　　率(﹪)VEGFR3阳性

　　率(﹪)LVD

　　乳腺癌组织(n=37)75.6778.3856.7515±5

　　正常乳腺组织(n=30)46.67*13.33#10.00#5±5#

　　注：与乳腺癌组比较，*P<0.05，#P<0.01

　　2.2 TP、VEGFD、VEGFR3表达及LVD与乳腺癌临床病理特征及预后的关系 TP、VEGFD、VEGFR3阳性率及LVD在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组织(P<0.05)，组织学分级越高，TP、VEGFD、VEGFR3表达LVD增强(P<0.05)。见表2。

　　表2 乳腺癌中TP、VEGFD、VEGFR3表达及LVD与

　　临床病理特征的关系

　　项目例数TP阳性率(%)P值VEGFD

　　阳性率(%)P值VEGFR3

　　阳性率(%)P值LVD(±s)t值

　　年龄

　　<502373.91>0.0578.2670.0552.17>0.056.2±3.2>0.05

　　≥501470.5778.5764.287.1±2.0

　　肿瘤大小

　　<201070.00>0.0540.00<0.0120.00<0.058.4±4.2>0.05

　　≥202777.7792.5970.378±4

　　淋巴结转移

　　无1752.94<0.0158.82<0.0529.41<0.017.6±3.2<0.01

　　有2095.0075.0080.0013.6±2.4

　　组织子分级

　　Ⅰ742.85<0.0542.85<0.0528.570.057.8±3.2<0.01

　　Ⅱ2281.8186.3654.549.6±2.2<0.01

　　Ⅲ882.5087.5082.5016.3±3.6

　　2.3 乳腺癌中TP、VEGFD、VEGFR3表达与淋巴管计数关系 TP、VEGFD、VEGFR3阳性表达中LVD明显高于TP、VEGFD、VEGFR3阴性表达(P<0.01)。见表3

　　表3 乳腺癌中TP、VEGFD、VEGFR3表达与淋巴管计数关系

　　项目例数LVD(±s)t值P值

　　TP

　　+2816±45.18<0.01

　　-99±3

　　VEGF-D

　　+2911.2±3.16.81<0.01

　　-82.2±2.9

　　VEGFR3

　　+2112.7±2.87.51<0.01

　　-162.2±2.9

　　3 讨论

　　乳腺癌是女性最常见，最多发的恶性肿瘤，严重危害其生命健康，乳腺癌容易发生淋巴结转移，淋巴管是肿瘤细胞扩散的主要途径[7]，肿瘤诱导淋巴管生成是淋巴道转移的重要步骤。肿瘤淋巴管生成造成淋巴管密度增加，使肿瘤细胞有更多的机会侵入毛细淋巴管，进入区域淋巴结，形成了淋巴道转移[8]。TP可逆性催化胸苷去磷酸化，诱导明显的血管新生。是否有淋巴管生成作用未见报道。本研究发现，乳腺癌TP阳性表达率明显高于正常乳腺组织，无淋巴结转移组，组织学分级Ⅰ级病例TP表达阳性率明显低于有淋巴结转移及Ⅱ或Ⅲ病例，说明TP表达与乳腺癌发生、进展及转移等生物学行为有密切关系。乳腺癌中TP阳性表达淋巴管计数明显高于阴性病例。况明TP具有促进肿瘤淋巴管生成作用。

　　VEGFD为淋巴管生长因子，可与淋巴管内皮细胞上的VEGFR3结合并使之激活，促进淋巴管内皮细胞的增殖和淋巴管的生成[9]。本研究中VEGFD、VEGFR3在乳腺癌组织中表达高于正常乳腺组织，提示VEGFD、VEGFR3在肿瘤发生发展中起作用：VEGFD、VEGFR3在淋巴结转移组及组织学分级Ⅲ级明显高于无淋巴结转移组及组织学分级Ⅰ级或Ⅱ级，表明VEGFD、VEGFR3与乳腺癌淋巴道转移有关，是乳腺癌预后的一项辅助判断指标：VEGFD、VEGFR3阳性表达中淋巴管计数显著高于阴性病例，表明VEGFD、VEGFR3具有促进肿瘤淋巴管生成作用。

　　肿瘤胚胎性抗原M2A是一种40KD的唾液酸糖蛋白，D240最初是从胎儿的睾丸和生殖细胞肿瘤中分离出的M2A抗原，能与淋巴管内皮反应，不与血管内皮反应，被认为是最具特异性的淋巴管标记物。本实验中D240特异性地表达在淋巴管内皮细胞内，癌栓多见于癌周围扩张淋巴管。乳腺癌组织中LVD显著高于正常乳腺组织，提示乳腺癌中有大量淋巴管生成;LVD在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组;组织学分级越高LVD越大，提示淋巴管数量多少与淋巴结转移密切相关，是判断乳腺癌预后的重要指标。乳腺癌组织中TP、VEGFD、VEGFR3的表达及淋巴管计数具有高度的一致性，表明三者在乳腺癌的淋巴管生成，淋巴结转移中起协同作用。

　　由此可见：TP、VEGFD、VEGFR3可促进乳腺癌淋巴管生成，是乳腺癌经淋巴道侵袭转移的重要因子，淋巴管数目的增多，使癌细胞更易于侵入淋巴管从而促进了淋巴结转移。乳腺癌中TP、VEGFD、VEGFR3有助于判断乳腺癌的转移和预后。

　　【参考文献】

　　1 Takeboyashi Y,Natsugoe S，Baba M,et al.Thymidine phosphorylase in human esophageal squarnous cell Carcinoma.Cancer，1999，85:282289.

　　2 Ranieri G,Roccaro AM,Vacca A，et al Thymidine phosphorylase (platelerderived endothelial cell growth factor)in cancer biology and treatment.Lancet Oncol,2005，6:158166.

　　3 Terashima M，Fujiwara H，Takagane A,et al.Role of thymidine phosphorylase and dihydropyrimidine dehydrogenase in tumor progression and sensitivity to doxifluridine in gastic cancer patients.Eur J Cancer,2002，38：2375238l.

　　4 Tadallashim Yoshimoto T, kubo H.Molecular mechanisns of lymphangiogenes Ns.Int J Hematol,2004，80:2934.

　　5 Weidner N.Cncarrent pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors.Breast Cancer Res Treat,1996，36:169180.

　　6 Uehida K，chamdhary LR，Suginmra Y,et al.Protein convertases regulate activity of prostate epithelial cell difierentiation markers and modlate in human prostate cancer cells.J cell Biochem,2003，88:394349.

　　7 Durme AA，Wemar JA.Fanetional anatomy of lymphatic vessels under the aspect of tumor invasion.Recent Results Cancer Res，2000;157:8289.

　　8 Veikkola T. Jaknqen I.MAKnqEN T,et al.SignaLingvia vascular endothelial growth factor receptor 3 is sufficient for lymphangiogenesis in transgeniemice2003,60:12231234.

　　9 Funaki H，Nishimura G，Harada S,et al.Expression of vascular endothelial growth factor D is associatecl with lymph node metastasis in human colorectal carcinoma.Oneology,2003,64:41622.