VEGF、MMP2与TIMP2在大肠癌中的表达

　　 作者：李春光 作者单位：430071 武汉大学中南医院肿瘤科，病理教研室;湖北省肿瘤医院化疗科

　　【摘要】 目的 研究VEGF、MMP2与TIMP2在大肠癌组织中的表达、相互关系及与肿瘤生物学行为的相关性。方法 对54例大肠癌患者的手术切除之癌组织和癌周正常组织，应用免疫组织化学方法检测其VEGF、基质金属蛋白酶MMP2和组织金属蛋白酶抑制剂TIMP2的表达情况，探讨两者之间的相互关系及其与肿瘤生物学行为的相关性。结果 VEGF、MMP2与TIMP2这三种蛋白在肿瘤组织中表达水平明显高于在正常组织中的表达。这三种蛋白的表达呈正相关，且表达水平与组织类型、组织分化程度、淋巴结转移、临床分期和五年生存率有统计学相关性(P<0.05)。结论 大肠癌中VEGF、MMP2与TIMP2的表达，可能是癌肿发生、生长和浸润转移的重要因素，可作为判断肿瘤恶性程度的重要指标。

　　【关键词】 大肠癌 血管内皮生长因子 基质金属蛋白酶MMP2 组织金属蛋白酶抑制剂TIMP2

　　0 引言

　　本实验采用免疫组织化学方法研究基质金属蛋白酶MMP2及其抑制物TIMP2和VEGF的表达及其与大肠癌生物学行为的相互关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　收集武汉大学中南医院1997年1月～1998年6月手术切除的大肠癌石蜡包埋组织标本54例，男32例，女22例：年龄42岁至76岁，平均年龄为57岁。所有病人术前均未接受放化疗。其中高、中分化大肠癌17例，低分化37例，术前Duke's分期A期15例，B期12例，C期16例，D期11例。同时取距上述癌组织边缘10cm处的正常组织石蜡标本。以上所有标本均经过临床和病理诊断证实。

　　1.2 主要试剂

　　抗MMP2和抗TIMP2鼠源单克隆一抗，购于福州迈新试剂公司;抗VEGF鼠源单克隆一抗，购于武汉博士德试剂公司;SP试剂盒和3,3二氨基联苯胺(DAB)，购于北京中山试剂公司。

　　1.3 组织标本的制备

　　将组织标本(大肠癌和正常组织)经福尔马林固定后，脱水、透明、浸蜡包埋，4℃保存，收齐后制备成4μm厚连续切片。

　　1.4 HE染色

　　切片脱蜡入水后水洗，苏木精室温下染色1min，1%盐酸酒精分色3秒，1%氨水返蓝5min，伊红室温下复染5min，再递度脱水透明，中性树胶封片。镜下观察组织形态学变化。

　　1.5 组织标本免疫组织化学染色

　　用免疫组织化学(SP法)检测VEGF、MMP2和TIMP2蛋白三种标志物的表达变化，按试剂说明书进行操作。切片脱蜡入水后，3% H2O2室温孵育15min，PBS水洗5min×3次，柠檬酸盐缓冲液微波修复95℃～98℃ 15 min，自然冷却至室温(约25℃)。擦干切片周围水份，正常封闭血清室温下孵育15min，甩干，加入一抗工作液37℃下孵育2h(空白对照片不加一抗，用PBS替代，其余步骤不变)，PBS漂洗3次，加入生物素标记的二抗，37℃下孵育15～20min，PBS漂洗3次，SP复合物37℃下孵育15～20min，使其充分反应，PBS漂洗5min×3次，DAB室温下显色，镜控反应时间，充分冲洗中止反应。苏木精复染胞核，染色1min，1%盐酸酒精分色3 秒，1%氨水返蓝5 min，脱水透明、封片。

　　1.6 阳性结果的判定和图像分析

　　VEGF，MMP2和TIMP2在光镜下有棕黄色颗粒反应出现在细胞膜、细胞浆中均为阳性反应细胞。根据阳性肿瘤细胞数的百分比判断结果。其中VEGF高倍镜下阳性细胞数占视野10%以下为阴性(-);大于10%以上计为阳性。10%～30%为(+)，30%～50%为(++)，>50%为(+++)。MMP2和TIMP2高倍镜下未见阳性细胞者为阴性(-);阳性细胞数占视野25%以下为弱阳性(+); 25%～75%者为阳性(++);>75%为强阳性(+++)。

　　1.7 统计学分析

　　用统计分析软件SPSS11.0对各指标表达结果进行统计学处理， 取α=0.05水准。

　　2 结果

　　2.1 HE染色结果

　　肿瘤组织中癌细胞体积大， 核大而圆， 病理分裂相多见， 肿瘤呈浸润性生长， 其中新生血管分布呈明显的异质性、 新生血管面积小， 畸形扭曲或扩张， 有的缺乏完整的基膜结构， 新生血管多位于肿瘤组织的边缘部分， 在浸润灶旁可见明显的新生血管增生。

　　2.2 VEGF、MMP2和TIMP2在大肠组织中的表达

　　三者均在正常大肠组织免疫反应呈弱阳性信号，在癌组织中呈强阳性信号，阳性物质呈棕黄色，且主要位于胞膜和胞浆，其中强阳性染色的肿瘤细胞多位于肿瘤浸润前缘,结果如表1所示。

　　表1VEGF、 MMP2和TIMP2在大肠癌组织中的表达(略)

　　注: 表中数据依次代表VEGF/MMP2/TIMP2的例数及结果

　　2.3 VEGF、MMP2和TIMP2在大肠组织中的表达的相关性分析

　　对VEGF、MMP2和TIMP2在大肠癌组织中表达情况，俩俩均采用spearman等级相关分析，VEGF和MMP2相关系数rs=0.762，P=0.000，VEGF和TIMP2相关系数rs=0.698，P=0.000，MMP2和TIMP2相关系数rs=0.671，P=0.000，表明他们之间有明显相关性。

　　3 讨论

　　近年来，人们对肿瘤浸润与转移机制进行了广泛的研究，发现血管内皮生长因子VEGF和基质金属蛋白酶MMP在肿瘤的浸润与转移中起重要作用。

　　VEGF又称血管通透因子，是目前已知的作用最强的促血管形成因子之一，也是肿瘤细胞分泌的血管形成因子中最重要的一种。VEGF在肿瘤组织中高表达，不但促进肿瘤的血管生成，也促进了肿瘤的侵袭和转移，与多种肿瘤的发生、转移和预后密切相关[1，2]。

　　基质金属蛋白酶(MMP)是近年来在研究细胞外基质合成与降解平衡中引起关注的一组酶，几乎能降解细胞外所有成分，MMP在转移癌中明显高表达，与转移密切相关[3]。其中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP2)能够特异的降解细胞外基质和基底膜的主要成分IV型胶原，被认为是在肿瘤侵袭转移过程中最直接和最重要的基质金属蛋白酶[4]。

　　组织金属蛋白酶抑制剂TIMP2是MMP2的特异抑制因子[5]。正常情况下，在机体内活化的MMPs和TIMPs之间存在一种平衡关系，正是这种平衡关系，决定MMPs的活性。如果这一平衡关系改变，将影响细胞间的浸润。

　　本研究发现，在大肠癌中VEGF、MMP2与TIMP2蛋白免疫染色阳性率较之正常组织明显增加，并均与肿瘤恶性程度、转移、Duke's分期和五年存活率密切相关。进一步分析三者之间的相关性，发现在大肠癌组织中，VEGF、MMP2与TIMP2三者之间的表达呈高度正相关。这表明，在大肠癌的发生发展和浸润转移过程中，VEGF和MMP2起着重要的作用，而且VEGF和MMP2之间存在某种内在联系，两者相互协同，相互促进，在共同的机制作用下，导致肿瘤的发展、浸润和转移。Zucker等发现，肿瘤血管形成早期VEGF可诱导内皮细胞产生组织因子和基质金属蛋白酶，使凝血酶原转化成凝血酶，从而激活明胶酶原A降解原来的基膜，使细胞增殖[6]。这与本文的观点是一致的。另外，TIMP2也与VEGF和MMP2的表达呈正相关性，这可能是由于随着MMP2在大肠癌的高表达，TIMP2也反馈性高表达，但却无法抑制MMP2的作用。这一结果暗示TIMP2对MMP2的抑制作用有随大肠癌的恶化而减弱趋势。

　　由此可见，VEGF、MMP2、TIMP2在肿瘤的恶性生物学行为中起重要作用，其高表达者肿瘤恶性程度高、易于转移，临床预后差;可作为判断肿瘤恶性程度和转移的一种生物学指标。

　　【参考文献】

　　[1] Brown LF, Berse B, Jackman RW, et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growtg factor) and its receptor in adenocarcinomas of the gastrointestinal tract[J]. Cancer Res,1993,53(19):47274736.

　　[2]　Evelyne D, Patricia H, Aude V, et al. Tumor angiogenesis and tissue factor expression during hepatocellular carcinoma progression in a transgenic mouse model[J]. J Hepatol,2003,38(6):793802.

　　[3]　Murray GI. Matrix metaloproteinases: a multifunctional group of molecules[J]. J Pathol, 2001,195 (2):135137.

　　[4]　Loukopoulos P, Mungall BA, Straw RC, et al. Matrix metalloproteinase2 and9 involvement in canine tumors[J]. Vet Pathol,2003,40(4):382394.

　　[5]　Worley JR, Thompkins PB, Lee MH, et al. Sequence motifs of tissue inhibitor of metalloproteinases 2 (TIMP2) determining progelatinase A (proMMP2) binding and activation by membranetype metalloproteinase 1(MT1MMP)[J]. Biochem J,　2003,372(3):799809.