p16INK4A和bcl2蛋白在CIN和宫颈鳞癌中的表达

　　作者：石新兰，黄利鸣，黎家华 作者单位：443002 宜昌，三峡大学医学院病理教研室

　　【摘要】 目的 探讨p16INK4A和bcl2在宫颈上皮内瘤(CIN)和宫颈鳞癌的表达状态及其在病理诊断中的意义。方法 采用免疫组化SP法对39例CIN、24例浸润性宫颈鳞癌和20例正常宫颈组织进行p16INK4A和bcl2检测。结果 正常宫颈组织不表达p16INK4A，CINⅠ阳性表达率很低并为局灶表达，但几乎所有的CINⅡ/Ⅲ和浸润性宫颈鳞癌均弥漫大量表达p16INK4A。正常宫颈组织只有基底细胞层表达bcl2蛋白，CINⅢ和Ⅰ～Ⅱ期浸润癌bcl2阳性细胞弥漫分布，阳性表达率分别为53.8%和57.1%。Ⅲ～Ⅳ 期浸润癌bcl2阳性率下降，阳性细胞局限。结论 p16INK4A过表达与宫颈鳞癌恶性特性密切相关，检测p16INK4A有助于及时发现高级别CIN和宫颈鳞癌。

　　【关键词】 p16INK4A蛋白;bcl2蛋白;宫颈鳞癌;宫颈上皮内瘤

　　The Expression and Value of p16INK4A and bcl2 in Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Squamous Carcinoma

　　SHI Xinlan, HUANG Liming, LI Jiahua

　　Department of Pathology, Medical School of China Three Gorges University, Yichang 443003，China

　　Abstract：Objective To study the expression and value of p16INK4A and bcl2 in CIN and cervical squamous carcinoma.Methods 39 cases of CIN, 24 cervical invasive squamous carcinoma and 20 normal cervical tissues were stained for p16INK4A and bcl2 by immunohistochemistry method. Results p16INK4A immunoreactivity was absent in all normal cervical tissues, its positive rate in CINⅠ was very low too, but p16INK4A expressed almost in all of CIN Ⅱ/Ⅲ and invasive carcinoma. Bcl2 immunoreactivity in normal cervical tissues was only seen in cells of basal layer. Its positive rate in CIN Ⅲ and Ⅰ～Ⅱ stage invasive carcinoma were 53.8%and57.1% respectively, which positive cells were diffuse and its staining intensity was higher than in normal cervical tissues. Its positive rate in Ⅲ～Ⅳ stage invasive carcinoma was striking decreased, which positive cells were focal. Conclusion p16INK4A over expression may be seen as a marker of CIN Ⅱ/Ⅲ and invasive carcinoma which is useful in pathological diagnosis.

　　Key words：p16INK4A protein;bcl2 protein;Cervical squamous carcinoma; CIN

　　0 引言

　　绝大多数宫颈鳞癌由宫颈上皮内瘤(CIN)发展而来，及时、正确诊断和治疗CIN，特别是CINⅡ/Ⅲ，是降低宫颈鳞癌发病率和死亡率的有效措施。对高级别CIN和典型的宫颈鳞癌不难做出正确的病理诊断，但如何准确鉴别CINⅠ和CINⅡ却存在着一定的困难，鳞状上皮化生与高级别CIN从形态上也有一定的相似性，有时也容易出现误判。因此，寻求特异性分子标记物是客观、准确诊断CIN所必需。研究表明p16INK4A特异性地表达于高级别CIN和宫颈鳞癌，并能间接地抑制bcl2表达，从而诱导宫颈癌的发生 [13]。本研究对正常宫颈、各级CIN和浸润性鳞癌组织进行了p16INK4A和bcl2免疫组化染色，以探讨p16INK4A和bcl2在宫颈鳞状上皮的表达状态及其临床意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　收集三峡大学第二临床医学院病理科近10年宫颈手术或活检标本83例，其中，正常宫颈20例，CIN39例，浸润性宫颈鳞癌24例。术前均未进行针对肿瘤的特殊治疗。福尔马林固定，石蜡包埋，病理医师确诊。浸润性宫颈鳞癌按1995年FIGO标准分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

　　1.2 试剂与方法

　　采用免疫组化SP法，即用型鼠抗人p16INK4A单抗、鼠抗人bcl2单抗及免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。用已知染色阳性的宫颈组织切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。操作步骤严格按照试剂盒说明进行，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。

　　1.3 结果判断

　　p16INK4A定位于细胞质和细胞核，bcl2定位于细胞质，以光镜下出现棕黄色颗粒为阳性染色。结合阳性细胞数目和分布范围进行结果判定。p16INK4A判定标准为：观察5个高倍视野，阳性细胞数少于观察细胞总数的10%为阴性表达;超过观察细胞总数的10%但局限于上皮下1/3层为阳性表达;超过观察细胞总数的10%并分布范围超过上皮下1/3层为强阳性表达。bcl2判定标准为：观察5个高倍视野，阳性细胞数少于观察细胞总数的10%为阴性表达;超过观察细胞总数的10%为阳性表达。统计学处理采用χ2检验。

　　2 结果

　　p16INK4A在正常宫颈鳞状上皮不表达，13例CINⅠ仅有2例局灶表达，所有的CIN Ⅱ/Ⅲ均表达p16INK4A，24例浸润癌仅1例无p16INK4A表达。CINⅢ和浸润癌阳性细胞均呈弥漫分布。

　　正常宫颈鳞状上皮基底细胞层都表达bcl2，而基底细胞层以外的鳞状上皮都不表达bcl2。CINⅠ/Ⅱ bcl2仍只表达于基底细胞层。CINⅢ和Ⅰ～Ⅱ期浸润癌bcl2阳性表达率高而阳性细胞弥漫分布。Ⅲ～Ⅳ 期浸润癌bcl2阳性表达率下降而阳性细胞局灶分布，见表1。表1 宫颈组织p16INK4A和bcl2表达与临床病理因素的关系(略)

　　3 讨论

　　在科技迅猛发展的今天，病理诊断仍然是疾病诊断的金标准，发挥着指导治疗和判断预后的作用。但是，病理诊断在很大程度上依赖于病理医生的阅片经验。因此，经常出现病理医生之间诊断意见不一致的现象。虽然病理医生对CIN和宫颈鳞癌的组织学特征很熟悉，但病理诊断的不一致率仍然很高。Klaes等 [4]发现CINⅡ病理诊断一致率仅为35%，非典型增生以外的宫颈病变病理诊断一致率仅为3%。可见，为了准确对宫颈组织切片和细胞涂片进行病理诊断，病理工作者必须寻找有效而客观的诊断指标。

　　肿瘤抑制基因p16INK4A编码蛋白是细胞周期素依赖激酶4(CDK4)抑制剂，与细胞周期蛋白D1竞争性地结合于CDK4，抑制细胞增殖。多种肿瘤的发生与p16INK4A突变、丢失或甲基化有关，但宫颈非典型增生和宫颈鳞癌却以p16INK4A过表达为特征。Klaes等 [1]研究结果表明几乎100%的高级别CIN和浸润癌都表现为p16INK4A免疫组化染色强阳性，而其他的宫颈鳞状上皮则不能检测到p16INK4A，即p16INK4A免疫组化染色有助于在组织切片上分辨出非典型增生的细胞和癌细胞。Murphy等 [2]也发现p16INK4A特异性表达于CINⅢ和宫颈浸润癌的胞质。Kalof等 [3]研究证明p16INK4A免疫组化染色强度与CIN程度相关，虽然CINⅠ也可呈现 p16INK4A阳性结果，但2/3层以上上皮弥漫阳性着色的结果几乎全部出现在CINⅡ/Ⅲ病例。本研究也取得了相似的结果，正常鳞状上皮不表达p16INK4A，而CINⅡ/Ⅲ和浸润性鳞癌几乎都表达p16INK4A，并且阳性细胞均为弥漫分布。说明p16INK4A异常过表达特异性地出现在高级别CIN和浸润性宫颈鳞癌。因此，用免疫组化方法检测p16INK4A表达状态有助于诊断高级别CIN和宫颈鳞癌，特别有助于辨认微小CIN病灶及早期浸润癌，使CIN和宫颈鳞癌的病理诊断更加客观，避免对高级别CIN和微小浸润癌的漏诊，避免将良性宫颈病变误诊为宫颈鳞癌。在临床上对怀疑有CIN或宫颈鳞癌者进行p16INK4A免疫组化检测有助于及时诊断高级别CIN和宫颈鳞癌病人，以免延误治疗。

　　p16INK4A表达状态不仅与CIN程度呈正相关，与高危型人乳头瘤病毒(HRHPV)感染也呈正相关。Kalof等 [3]发现100%CINⅡ/Ⅲ都可检测到与宿主DNA整合的HRHPV信号，而CINⅠ其整合率仅为13.6%，HRHPV整合信号阳性的CIN组织p16INK4A染色强度显著增高。Murphy等 [5]也证实p16INK4A表达强度与HRHPV感染密切相关。Guimaraes等 [6]对65例低级别CIN进行研究，发现进展到高级别CIN者，p16INK4A过表达，并与HPV16/18检出之间显著相关，而维持于低级别CIN者p16INK4A表达状态与HPV16/18检出之间并无此相关性，说明HPV16/18感染可导致宿主细胞高表达p16INK4A，并使病变进一步演进。关于HRHPV感染促使p16INK4A高表达的机制，可能是HRHPV序列整合到宿主细胞DNA，导致病毒E7蛋白过表达，而过表达的E7蛋白可削弱抑癌基因Rb功能，使细胞周期失调，并促进p16INK4A过表达 [4]。

　　bcl2蛋白为凋亡抑制基因bcl2表达产物，可抑制细胞凋亡，促进肿瘤发生。不同的恶性肿瘤，其表达状态不同。文献报道宫颈鳞癌bcl2阳性表达率从17% [7]～54% [8]不等。多数研究 [710]表明CINⅢbcl2阳性表达率明显高于CINⅠ/Ⅱ和浸润癌，而正常宫颈鳞状上皮阳性细胞仅限于基底细胞层 [9，11]。本研究结果显示正常宫颈和CIN Ⅰ/Ⅱbcl2阳性表达均限于基底细胞层，而CINⅢbcl2阳性细胞范围扩大，基本与非典型增生范围一致，阳性表达率高达54.6%，即bcl2在CINⅢ的表达状态与CIN Ⅰ/Ⅱ有显著性差异。5例Ⅰ期浸润性鳞癌有4例表达bcl2，阳性细胞弥漫分布，而Ⅲ～Ⅳ 期浸润癌bcl2阳性表达率降至23.5%且癌细胞局灶阳性。可见，bcl2表达状态对筛选高级别CIN有一定的参考价值，但诊断浸润性鳞癌时，其参考价值不大。bcl2表达于正常鳞状上皮基底层，可能与基底细胞分裂增生活跃有关。CINⅢ和Ⅰ期浸润性鳞癌bcl2阳性细胞增多，阳性程度增强，导致恶性细胞抗凋亡能力增强，增大了病变进一步发展的可能性。

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