PTEN、MMP7、VEGF在骨巨细胞瘤中的表达

　　作者：陈述伟,杨述华,张劲松,朱续胜，袁永辉 作者单位：1.430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科;2.华中科技大学同济医学院病理科

　　【摘要】 目的 探讨骨巨细胞瘤中的PTEN、MMP7、VEGF表达与“三结合分类”、病理分级及复发、转移的关系。方法 采用免疫组化法检测65例骨巨细胞瘤标本PTEN、MMP7、VEGF基因蛋白的表达，分析其与骨巨细胞瘤临床病理分期、分级及复发、转移的关系。结果 PTEN、MMP7、VEGF的阳性表达率分别为56.95%、72.30%、49.20%;在“三结合分类”组中PTEN的阳性表达率分别为83.3%、68.10%、28.00%，呈下降趋势，良性与中间性组间差异不显著(P=0.271)，而中间性与恶性组间差异明显(P=0.001);而MMP7阳性表达率分别为39.00%、72.50%、96.00%，VEGF阳性表达率分别为16.67%、54.50%、68.00%，组间差异明显(P=0.031、0.001);在转移组中PTEN、MMP7、VEGF的阳性表达率分别为30.00%、100%、85.00%，在无转移组中PTEN、MMP7、VEGF的阳性表达率分别为68.80%、60.00%、33.3%，两组间差异明显(P=0.003、0.001、0.001);复发组中PTEN、MMP7、VEGF的阳性表达率分别为33.30%、93.30%、86.60%，无复发组中PTEN、MMP7、VEGF的阳性表达率分别为64.00%、66.00%、38.00%，两组间差异明显(P=0.035、0.038、0.001)，且PTEN与MMP7、VEGF负相关(P=0.001、0.020)，而与病理分级及年龄、性别无统计学差异。结论 PTEN、MMP7、VEGF的表达与“三结合分类”有一定的关系，并与转移、复发显著相关，联合检测有助于骨巨细胞瘤的临床评估，对其预后判断具有重要临床意义。

　　【关键词】 骨巨细胞瘤;PTEN;MMP7;VEGF;免疫组织化学

　　Expressions of PTEN and MMP7、VEGF in Giant Cell Tumor of Bone (GCT)

　　CHEN Shuwei, YANG Shuhua, ZHANG Jingsong, ZHU Xusheng, YUAN Yonghui

　　1.Department of Orthopaedics，Xiehe Hospital，TongJi Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China;2.

　　Department of Pathology，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology

　　Abstract：Objective To evaluate the expressions of PTEN ( phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10) ，MMP7(matrix metalloproteinases7，MMP7)，VEGF (vascular endothelial growth factor) and their relationships with clinical factors，pathological types and metastasis，recurrence of giant cell tumor of bone (GCT).Methods The expressions of PTEN， MMP7， VEGF in 65 cases of human GCT were detected by using immunohistochemical staining. The expressions of PTEN， MMP7， VEGF and other clinical fractures were analyzed with the metastasis and recurrence of the tumor. Results The expressions of the PTEN，MMP7，VEGF in GCT were 56.95% and 72.30%，49.20%, respectively. In the clinicalpathologicalXray groups, the expressions of PTEN were 83.30%，68.10%， 28.00%,the positive rate had no significantly difference between the Nonmalignant and doutful malignant groups, P>0.05(P=0.271), but there were significantly difference between the doutful malignant and malignant groups, P<0.05(P=0.001) ;the expression of MMP7 were 39.00%，72.50%，96.00%,and the expression of VEGF were 16.67%，54.50%，68.00%,the positive rates of them had significantly difference, P<0.05 (P=0.031,0.001);the expressions of PTEN ，MMP7，VEGF in the recurrence group were 33.30%，93.30%，86.60%, but in the nonrecurrence group were 64.00%，66.00%，38.00%,their expressions were statistically related to the recurrence of GCT, P<0.05 (P=0.035, 0.038,0.001); in the metastasis group, the expressions of PTEN ，MMP7，VEGF were 30.00%，100%，85.00%,in the no metastasis group ，the positive rates of PTEN，MMP7，VEGF were 68.80%，60.00%，33.30% ,the positive rates of them had significantly difference,P<0.05(P=0.003，0.001，0.001);at the same time, The expression of PTEN in GCT was inversely correlated with the expressions of VEGF and MMP7, P<0.05(P=0.001, 0.02) ; However, the expressions of PTEN 、 MMP7、VEGF had no statistically significance with the pathological types and sexuality.Conclusion The decreased expression of PTEN and increased expressions of MMP7、VEGF have significant relationship to the prognosis of GCT. The combined detection of PTEN and MMP7 may be of important clinical value to evaluate the infiltrative ability and prognosis of GCT.

　　Key words：Giant cell tumor of bone(GCT); PTEN/biosynthesis; MMP7/biosynthesis;VEGF/biosynthesis; Immunohistochemistry

　　0 引言

　　骨巨细胞瘤(Giant cell tumors of bone，GCT)是一种中间的，潜在的恶性肿瘤，其生物学行为复杂而多变，易发生转移与复发。与肿瘤细胞的增殖调控、基底膜的降解、血管的增生密切相关。我们应用免疫组织化学方法，联合检测PTEN、MMP7、VEGF在骨巨细胞瘤中的表达，探讨其与肿瘤细胞的生长、增殖、浸润和转移等生物学行为及其与临床病理分期分级的关系，旨在为治疗GCT与评估预后提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 样本来源

　　选择1995年8月25日～2004年8月23日华中科技大学同济医学院附属协和医院(48例)、同济医学院病理科(17例)，有完整随访资料的手术切除骨巨细胞瘤标本共65例，其中男38例，女27例，年龄15～58岁，平均年龄35.2岁，中位数年龄28岁;单纯病灶刮除12例，切除加阿霉素骨水泥填塞16例，广泛切除及人工关节置换37例;随访时间15～120个月，平均48.3个月;有15例复发，其中单纯病灶刮除组6例，切除加骨水泥组4例，广泛切除组5例;转移20例，其中Ⅰ级3例，Ⅱ级6例，Ⅲ级11例。根据Jafee 1940年提出的病理分级标准 [1]：Ⅰ级18例，Ⅱ级17例，Ⅲ级30例。结合临床、病理、影像学表现，即“三结合分类”，参考WHO(2002)骨肿瘤分类标准 [2]，良性18例，恶性25例，中间性22例。

　　1.2 主要试剂

　　PTEN兔抗人多克隆抗体，MMP7、VEGF鼠抗人单克隆抗体，羊抗兔、羊抗鼠SP试剂盒及DAB显示剂，均购自北京中山生物技术公司。

　　1.3 方法

　　各种标本常规石蜡包埋，5μm连续切片，分别做HE和免疫组化染色，免疫组化染色为SP法，染色方法依说明书进行，阳性对照采用已知实验中证实对本实验所用抗体呈阳性反应的阳性切片，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判定

　　参照 Axiotis 等 [3]标准，由两位病理科医生采用双盲法独立检测，PTEN、MMP7、VEGF阳性细胞均为细胞质中出现明显的棕黄色或深黄色颗粒，每例病理切片取5个高倍镜视野进行结果判定，按染色强度及阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比综合计分:(1)染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分;(2)阳性细胞数：5个高倍镜视野在每张切片上计算200个癌细胞，阳性细胞数≤10%为0分, 阳性细胞数11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～100%为3分，两类分数乘积， 0～2分者为阴性(-)，3分及以上者为阳性。

　　1.5 统计学方法

　　应用 SPSS12.0统计软件进行分析，计数资料组间比较采用χ2检验，PTEN与MMP7、VEGF 的相关性比较采用Spearman等级相关分析。

　　2 结果

　　2.1 PTEN、MMP7、VEGF在骨巨细胞瘤中的表达

　　65例骨巨细胞瘤中PTEN、MMP7、VEGF的阳性表达率分别为56.95%、72.30%、49.20%，三者者均为胞浆表达，PTEN主要表达在多核细胞，在多核瘤巨细胞中更为明显，MMP7、VEGF在单核或者多核细胞中都有表达，且肿瘤边缘或增生活跃部位着色深，部分内皮细胞也着色。

　　2.2 PTEN、MMP7、VEGF与病理分级、“三结合”分类的关系

　　按骨巨细胞瘤“三结合分类”即结合临床、病理、影像学，PTEN蛋白在良性、中间性、恶性组间阳性表达率分别为83.30%(15/18)、68.10%(15/22)、28.00%(7/25)，各组间阳性率呈下降趋势，良性与可疑恶性差异无显著，P>0.05(P=0.271)，但可疑恶性、恶性之间差异呈显著性改变，P<0.05(P=0.001)，而MMP7、VEGF的阳性表达率则呈上升趋势，三组间的阳性率分别为39.00%(7/18)、72.50%(16/22)、96.00%(24/25)及16.67(3/18)、54.50%(12/22)、68.00%(17/25)，组间差异明显，P<0.05 (P=0.031、0.001);而在病理分级各组之间，PTEN 的阳性表达率分别为61.10%(11/18)、58.80%(10/17)、53.30%(16/30)，MMP7的阳性表达率分别为50.00%(9/18)、70.50%(12/17)、86.60%(26/30)， VEGF的阳性表达率分别为33.30%(6/18)、41.10%(7/17)、63.30%(19/30)，三者阳性表达率差异无统计学意义，P>0.05(P=0.890、 0.214、0.631)。

　　2.3 PTEN、MMP7、VEGF表达与肿瘤复发转移的关系

　　骨巨细胞瘤复发组与无复发组中，PTEN的阳性率分别为33.30%(5/15)、64.00%(32/50)， MMP7的阳性率分别为93.30%(14/15)、66.00%(33/50);VEGF阳性表达率分别为86.60%(13/15)、38.00%(19/50)，两组之间差异显著，P<0.05(P=0.035、0.038、0.01)。在转移组与无转移组中，PTEN阳性率分别为30.00%(6/20)、68.80%(31/45)，MMP7阳性率分别为100%(20/20)、60.00%(27/45)，VEGF阳性率分别为85.00%(17/20)、33.3%(15/45)，两组之间差异显著，P<0.05(P=0.003、0.001、0.001)

　　2.4 PTEN表达与MMP7、VEGF的相关性

　　对骨巨细胞瘤PTEN与MMP7、VEGF的阳性表达进行相关性分析，其相关系数(r=0.538, χ2=18.838,P=0.001;r=0.386，χ2=9.697，P=0.020)为负，表明两者存在明显负相关。

　　3 讨论

　　3.1 骨巨细胞瘤中PTEN阳性表达的意义

　　肿瘤细胞的增殖取决于细胞内外的正负信号在一定水平的动态平衡。PTEN是最近发现的第一个具有磷酸脂酶活性的主要通过对PI 3 K 的脂质产物ptdIns3，4，P2 及ptdlns3，4，5P3 (即PIP3)去磷酸化，拮抗Pf3 K/AKT通路发挥肿瘤抑制作用。现已明确AKT为PTEN 重要的应分子 [4，5]。此外，PTEN还具有蛋白磷酸酶功能，可使 FAK、SHC去磷酸化，该作用与PTEN调控细胞的粘附及转移有关;也与调控多种细胞存活的相关途径有关，如MAPK通路 [6]。文献报道 [7]，PTEN水平的变化与肿瘤的增殖、分化有关，在许多人类肿瘤(如消化道、淋巴造血系统、乳腺、前列腺肿瘤等)中，其表达的阳性率与这些肿瘤的恶性程度呈显著负相关。本实验结果显示，在骨巨细胞瘤中，随着“三结合分类”中恶性程度的增加及肿瘤的复发与转移，PTEN蛋白的表达呈显著性下降，提示其失活对骨巨细胞瘤的恶变及获得性转移潜能产生了重要作用。

　　3.2 骨巨细胞瘤中MMP7、VEGF阳性表达的意义

　　基质金属蛋白酶(Matrimetalloproteinases，MMPs)又称基质水解酶，是MMPs家族中分子量最小，但作用强大的一种水解酶，能降解胶原、明胶、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等构成基底膜和ECM的重要成分，已有研究表明MMP7的表达与肿瘤的增殖活性 [8]及肿瘤的浸润深度和淋巴结的范围有关 [9，10]。VEGF是一种肝素结合糖蛋白，是最主要的血管生成因子，通过血管内皮细胞表面的两个受体fit1和flk1的结合刺激内皮细胞的增殖，增加微血管的通透性，促进肿瘤血管的形成，为肿瘤快速增殖和转移提供条件 [11，12]。现代肿瘤学研究表明，血管的生成与肿瘤的转移密不可分，MMP7和VEGF协同表达，VEGF改变了内皮细胞的活化形式，增强了MMP7的释放，加快了基底膜的降解和内皮细胞的迁移 [13]，在本实验中二者共同阳性表达25例，阴性表达21例，二者关系密切(P<0.05)。

　　本实验研究结果显示PTEN蛋白在骨巨细胞瘤中表达降低与其“三结合分类”有一定关系，与其复发与转移密切相关，并与MMP7和VEGF显著负相关，提示联合检测 PTEN、MMP7、 VEGF可作为骨巨细胞瘤侵袭状态、转移与复发倾向的判定及手术方式选择的一种重要参考指标。

　　【参考文献】

　　[1]Jaffe HL, Lichtenstein L, Portis RB. Giant cell tumor of bone: Its pathologic appearance grading, supposed variants and treatment [J]. Arch Pathol, 1940, 30(3): 993995.

　　[2]Fletcher CDM ，Unni KK，Mertens F.WHO classification of tumors，pathology and genetics of tumours of soft tissue and bone [M]. 3rd ed. Lyon：IARC Press，2002.4550.

　　[3]Axiotis CA,Monteagudo C,Merino MJ,et al.Immunohistochemical detection of Pglycoprotein in andometrical adenocarcinoma [J]. Am J Pathol，1991，138(4)：799806.

　　[4]Stocker H, Andijeclkovic M, Oldham S, et al. Living with lethal PIP3 level: Viability of flies lacking PTEN restored by a PH domain mutation in AKT/PKB [J]. Science, 2002, 1295(5562):20882091.

　　[5]Maehama T, Taylor GS, Dixon JE, et al. PTEN and myotubulain:novel phosphoinositide phosphatases [J]. Ann Rev BIochem, 2001, 70(1): 247249.

　　[6]KangParks, Lee YI, L YI, et al. PTEN modulates insulin like growth factorⅡ (IGFⅡ)mediated signaling: the protein phosphatase activity of PTEN downregulates IGFⅡ Expression in hepatoma cell [J]. FEBS LETT, 2003,545(23):203208.

　　[7]Laura S,Ramon P. PTEN：Life as a tumor suppressor [J]. Exp Cell Res, 2001,264(10):2941.

　　[8]Liu XP,Oga A， Suehiro Y，et al.Inverse relationship between matrilysin expression and proliferative activitv of cells in advanced gastric carcinoma [J].Hum Patho1,2002,33(7):741747.

　　[9]Kitoh T,Yanai H,Saitoh Y,et al.Increased expression of matrix metalloproteinase7 in invasive early gastric cancer [J].J Gastroenterol,2004，39(5):434440.

　　[10]Ajisaka H,Yonemura Y,Miwa K.Correlation of lymph node metastases and expression of matrix metalloproteinase7 in patients with gastric cancer [J]. Hepatogastroenterology,2004,51(57):900905.

　　[11]Veikkola T,Karkkainen M,Claesson Wlesh L,et al.Regulation of angiogenesis Via Vascular endothelial growth factor receptors [J].Cancer Res,2000,60(5):203212.

　　[12]Brekken RA, Thorpe PE.Vascular endothelial growth factor and vascular targeting of solid tumor [J].Anticancer Res,2001,21(6):42214229.

　　[13]Hofmann UB,Westphal JR,Vanmuijen GN,et al.Matrix metalloproteinases in human melanoma [J].J Invest Dermatol,2000,115(3):337344.