靶向抑制PI3K/Akt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响

　　作者：石松菁, 黄昌明， 石松长 作者单位：福建医科大学省立临床医学院、福建省立医院内科 ICU，福州 350001;附属协和医院 肿瘤科,福州 350004;附属协和医院 急诊外科，福州 350004

　　【摘要】目的 研究LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路对线粒体激活因子(Smac)基因的表达及胃癌细胞凋亡的影响。 方法 将PI3K/Akt信号通路的靶向抑制剂LY294002加入胃癌细胞株SGC7901,四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖,DNA ladder检测细胞凋亡,原位细胞凋亡检测技术检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,免疫组织化学检测Smac的表达。 结果 LY294002致细胞存活率下降,且与时间、浓度呈正相关。在DNA电泳图上,对照组呈规则的基因组断裂条带,其亮度与药物作用时间呈正相关。流式细胞结果显示LY2940002处理后在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,作用12 h时,细胞凋亡达58.7%。Smac在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达;LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染。 结论 PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系密切。

　　【关键词】 1磷脂酰肌醇子激酶; 线粒体蛋白质类; 胃肿瘤; 肿瘤细胞, 培养的; 细胞凋亡

　　胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均较高,其异常的细胞凋亡和增殖在胃癌的形成和进展中具有重要意义。近年研究发现,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的线粒体激活因子(second mitochondriaderived activator of caspases,Smac)是一种从线粒体内释放到细胞质中的重要凋亡调节蛋白,能增加Caspase3活性,促进细胞凋亡[1]。笔者拟通过LY294002靶向抑制胃癌细胞SGC7901来探讨PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞株 胃癌细胞系SGC7901由本实验室传代培养,含10%小牛血清(美国SIGMA公司)的RPMI 1640培养基,在37 ℃培养箱中培养,2～3 d更换培养基1次

　　1.1.2 实验试剂 Smac多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);PI3K抑制剂LY294002(美国Promega公司);流式细胞仪(Coulter,Epicus ELITE,ESP,美国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 LY294002溶液的配置 按照配制说明书先将 LY294002干粉5 mg充分溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液325 μL中,配制成50 mmol/L的LY294002溶液,移入-20 ℃冰箱储存,用前稀释成所需的浓度。

　　1.2.2 四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长活性 选择对数生长期细胞,接种于96孔培养板,另设不加细胞的培养液为对照组。实验组分别给予终浓度为10,30,50 μmol/L的LY294002(DMSO≤0.05%),对照组加入同等浓度的DMSO,每孔设3个复孔。再培养4,8,12 h,每孔分别加入5 g/L的MTT 10 μL。加DMSO 100 μL,振荡。用酶标仪在波长490 nm处测每孔光吸收值(D),重复3次。计算：

　　细胞存活率(%)=D试验组/D对照组×100%。

　　根据MTT结果选择出干预浓度和时间。

　　1.2.3 DNA Ladder检测 收集各组细胞,用PBS重悬,加入细胞裂解液(1%NP40,20 mmol/L EDTA,50 mmol/L Tris)400 μL,反应10 min,离心收集上清,加入十二烷基硫酸钠(SDS)至1%浓度,加入RNA酶在56 ℃作用1 h,加入蛋白酶K 37 ℃处理过夜,乙醇沉淀DNA,TE溶解DNA,1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并拍照。

　　1.2.4 原位细胞凋亡检测技术(TUNEL)检测细胞凋亡 将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内,取对数生长期细胞。待细胞长满后,给予终浓度为10,30,50 μmol/L的LY294002(DMSO≤0.05%),分别培养4,8,12 h后,取出盖玻片,用4%多聚甲醛溶液固定,并与阻断剂室温孵育30 min。PBS洗片,与通透液在冰浴中孵育2 min。滴加TUNEL反应混合溶液50 μL,在湿盒中37 ℃孵育。加入转化剂(POD)50 μL,在37 ℃湿盒中孵育30 min。加入DAB底物溶液50～100 μL，封片,在光镜下分析结果：

　　细胞凋亡指数=凋亡细胞数倒置显微镜计数200个细胞

　　1.2.5 流式细胞仪检测 调整待测细胞的密度。设置对照组及观察组。收集细胞,70%冷乙醇固定24 h,10 μg/mL RNaseA 37 ℃温育30 min后,加碘化丙啶(PI)使其终浓度达20 μg/mL,暗处作用>0.5 h。

　　1.2.6 胃癌细胞SGC7901 Smac表达的检测 将细胞接种在放有盖玻片的6孔板内,当盖玻片面上的细胞长至70%～80%融合时,加入终浓度为50 μmol/L的LY294002,不加药物作为对照组,培养4,8,12 h,小心取出长有细胞的盖玻片,4 ℃冷丙醇固定,按试剂说明行SP法免疫组织化学染色,用PBS代替一抗作为阴性对照片。采用Gatalica等的半定量积分法计算[5]。

　　1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件,2组间各指标均数的比较采用t检验,多组间指标的比较均采用单因素方差分析(OneWay ANOVA)、LSDt和SNKq检验。计数资料比较采用卡方检验。P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT法检测胃癌细胞增殖 随着不同浓度LY294002作用时间延长,细胞的存活率呈逐渐下降趋势(P<0.05，表1)。

　　表1 四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率(略)

　　Tab 1 Cell viability of SGC7901 cells after exposure of LY294002(10～50 μmol/L) for 4,8,12 h

　　同一浓度LY294002干预不同时间相比较,#：P<0.01;△：P<0.01.

　　2.2 胃癌细胞凋亡结果

　　2.2.1 DNA Ladder结果 对照组呈规则的基因组断裂条带,50 μmol/L的LY294002作用4,8,12 h后,均可见180～200 bp的梯型条带,其亮度与药物作用时间呈正相关。随着LY294002作用浓度增加,胃癌细胞凋亡增加(图1)。

　　2.2.2 TUNEL检测结果 50 μmol/L LY294002作用4,8,12 h,细胞的凋亡指数上升,且在同一时间点上,随着干预浓度增加,细胞凋亡指数升高;在同一浓度点上,随着作用时间延长,细胞凋亡指数升高(表2,图2)。

　　M：maker;1：对照组;24：LY294002作用4,8,12 h.

　　图1 DNA Ladder 电泳图(略)

　　Fig 1 DNA Ladder

　　表2 TUNEL法检测细胞凋亡指数(略)

　　Tab 2 Cell apoptotic index of SGC7901 cells after exposure of LY294002(10～50 μmol/L) for 4,8,12 h

　　不同浓度LY294002干预相同时间相比较，#：P<0.01;同一浓度LY294002干预不同时间相比较，△：P<0.01.

　　2.3 胃癌细胞增殖周期改变 同一浓度LY2940002处理SGC7901细胞不同时间,在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,50 μmol/L LY294002处理8 h时,凋亡细胞就达33.7%;12 h时,凋亡细胞达58.7%(图3)。

　　2.4 LY294002对Smac蛋白表达的影响 Smac蛋白表达于细胞质内,呈淡黄色或棕黄色分布,在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达(χ2=36.246,P<0.05);经LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染(表3,图4)。

　　表3 同一浓度LY294002作用不同时间后Smac蛋白表达变化(略)

　　Tab 3 The expression of protein Smac after exposure of LY294002(10～50 μmol/L) for 4,8,12 h

　　箭头所指为阳性细胞. A：对照组;B～D：10 μmol/L作用4,8,12，随作用时间延长，阳性细胞粒增加h;E～G：30 μmol/L作用4,8,12 h，阳性细胞粒与作用时间成正比;H～J：50 μmol/L 作用4,8,12 h，作用时间越长，凋亡细胞越多.

　　图2 TUNEL法检测胃癌细胞凋亡(略)

　　Fig 2 TUNEL analysis

　　AP：凋亡细胞;A：对照组;B～D：LY294002 50μmol/L作用4,8,12 h.

　　图3 流式细胞检测不同浓度LY294002干预SGC7901细胞凋亡(略)

　　Fig 3 Flow cytometry analysis about apoptosis

　　箭头所指为阳性细胞. A：4 h;B：8 h;C：12 h,作用时间延长，细胞质着色增加.

　　图4 LY294002对Smac蛋白表达的影响(×400)(略)

　　Fig 4 The effect of LY294002 on the expression of protein Smac(×400)

　　3 讨论

　　3.1 PI3K/Akt信号通路与肿瘤 细胞通过各种通路所形成的复杂的网络来传递各种增殖和凋亡信号。其中,PI3K/Akt信号通路在多种人类肿瘤中表达失调,调节肿瘤细胞的增殖和凋亡,并与肿瘤的血管形成和侵袭转移也密切相关,因此影响患者的预后,同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。PI3K/Akt信号通路在胃肠道肿瘤的发生、发展中起关键作用。

　　3.2 PI3K抑制剂 目前PI3K的抑制剂只有LY294002和Wortmannin,它们是结构明显不同的复合物,工作浓度差异较大。尽管LY294002的工作浓度是Wortmannin的500倍,但由于其在溶液中较Wortmannin稳定性强,因此其作为PI3K的选择性抑制剂更有应用前景,已广泛用于细胞生物学研究[2]。研究表明,LY294002能够竞争性地抑制PI3K亚基中的ATP结合位点,进而抑制胃癌细胞的增殖,但同时它不抑制PKC、PKA、MAPK、EGFR等磷酸激酶的表达[35]。本研究结果显示,LY294002致细胞存活率下降,且与时间、浓度呈正相关,能有效抑制胃癌细胞的增殖，促进胃癌细胞的凋亡，这可能为肿瘤靶向药物的开发提供一条新的思路。

　　3.3 LY294002、PI3K/Akt信号通路与细胞 研究认为,在PI3K/Akt信号通路中,PI3K通过调节亚基中的SH2区域和受体接触,导致催化亚基的异构性激活。随着PI3K的激活,PIP3和含有PH区域的蛋白结合,导致这些蛋白构像的改变[6]。磷酸化结合的PH区域存在于大多数的蛋白中,它对于活化了的PI3K的转化是很重要的,可促进其下游分子Akt/PKB的磷酸化。随着其第308位上的苏氨酸位点和第473位的丝氨酸位点的磷酸化,可最大限度地激活Akt。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白,进而调节细胞的增殖、凋亡[78]。本研究显示,作为PI3K/Akt信号通路中PI3K的靶向抑制剂,LY294002可导致细胞存活率下降,且与时间、浓度呈正相关,这与上述相关研究结果相符。

　　3.4 Smac蛋白与胃癌细胞 Smac是近年新发现的一种从线粒体内释放到细胞质中的重要凋亡调节蛋白,是除细胞色素C外被认识的第二种线粒体促凋亡蛋白,能通过增强Caspase3活性,促进细胞凋亡[9]。本研究发现，Smac在细胞质表达与细胞凋亡的程度明显相关,随着凋亡增加,其表达增多,阳性率增强。可见,LY294002作用后,胃癌细胞Smac蛋白表达上调。笔者认为,LY294002作用于胃癌细胞,启动了细胞的凋亡程序,而这可能就包括了Smac蛋白的表达,从而进一步启动凋亡,促进凋亡进程。目前研究表明,Smac蛋白可通过两种途径促进凋亡,即对Caspase3的蛋白水解作用和增强成熟Caspase3的酶催化活性,故笔者推测Smac蛋白可能通过上述作用促进胃癌细胞凋亡,这可能为调控胃癌细胞凋亡提供一个新的途径。

　　【参考文献】

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