肿瘤标志物组合在乳腺癌防治中的应用

　　作者：陈少华 作者单位： 广东省封开县人民医院检验科，广东?封开

　　【摘要】 目的寻求乳腺癌标志物最佳组合，以提高乳腺癌诊断的准确性和灵敏度。方法采用ELISA法测定20例乳腺癌良性病变和85例乳腺癌患者治疗前血清肿瘤相关抗原(CA15-3)、癌胚抗原(CEA)、恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)和组织多肽特异性抗原(TPS)，荧光定量PCR(FQ-PCR)检测C-erbB2拷贝数。结果乳腺癌组CA15-3、CEA、TSGF和TPS、C-erbB2，5种标志物的水平及阳性率明显高于良性病变组(P<0.05或P<0.01)，在几种组合中，CA15-3、TSGF、C-erbB2三者组合在Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌中阳性率达90.9%。结论CA15-3、TSGF和C-erbB2联合检测是乳腺癌筛查较好的组合。

　　【关键词】 乳腺肿瘤;肿瘤标记，生物学

　　Abstract:ObjectiveTo explore the best tumor marker combination in diagnosis of breast cancer and to improve the diagnostic accuracy and sensitivity.MethodsThe enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect serum cancer antigen 15-3 (CA15-3), carcinoembryonic antigen (CEA), tumor specificgrowth factor (TSGF) and tissue polypeptide specific (TPS) in 20 patients with benign breast disease and 85 patients with breast cancer. Meanwhile the real-timefluorescent quantitative PCR(FQ-PCR) was used to detect the copies of C-erbB2.　ResultsThe levels and positive rates of CA15-3, CEA, TSGF, TPS and C-erbB2 in patients with breast cancer were higher, compared to those patients with benign breast disease, there were statistically significant differences (P<0.05 or P<0.01). The combination of CA15-3, TSGF,C-erbB2 has gained a higher positiverate (90.9%) than others in diagnosis of stagesⅠ,Ⅱ breast cancer.ConclusionThe combined detection of CA15-3, TSGF, C-erbB2is an effective method in screening breast cancer.

　　Key words:breast neoplasms; tumor markers, biological

　　近年来研究表明，乳腺癌已是女性健康的危险因素。乳腺癌早期诊断和治疗是防治乳腺癌的关键。关于乳腺癌诊断、疗效评估的手段、指标有很多，如超声影像、免疫组化、相关基因检测等。由于方法的限制，许多实验数据受到主观因素或工作熟练程度的影响，很难标准化，室间实验数据也没有可比性。我们以定量的方法检测敏感性和特异度相对较高的5个标志物：血清肿瘤相关抗原(CA15-3)、癌胚抗原(CEA)、恶性肿瘤特异性生长因子(TSGF)、组织多肽特异性抗原(TPS)、C-erbB2，研究它们在评估乳腺癌发生发展中的作用，特别是找到早期预测乳腺癌的可靠标志物。

　　1对象与方法

　　1.1检测对象所有纳入患者105例均为女性，良性组：20例，其中乳腺病6例，乳腺纤维瘤14例，平均年龄36岁。乳腺癌组：共85例，其中浸润性导管癌66例，浸润性小叶癌14　　例，髓样癌2例，乳腺浸润性筛状癌3例。采用1997年国际抗癌联盟公布的乳腺癌TNM分类法进行TNM分期，其中Ⅰ期27例，Ⅱ期25例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例，平均年龄44岁。两组病例均于治疗前清晨取静脉血3ml，所有乳腺癌均经病理确诊的初诊者，排除患有其它肿瘤。

　　1.2检测方法静脉血离心取上清液，ELISA法测CA15-3、CEA、TSGF、TPS，试剂盒购自瑞典CanAg公司和IDL生物试剂公司。原理为生物素-亲和素双单抗夹心法，形成亲和素-生物素-抗体-抗原-酶标抗体复合物，以日本BIO-RAD公司生产的MODEL550用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法细胞RNA。以逆转录FQ-PCR法检测。引物由上海生物工程公司合成，正反义引物分别为5’-AGCCGCGAGCACCCAAGT-3’，5’-TTGGTGGGCAGGTAGGTGAGTT-3’，探针：5’-CCTGCCAGATCCCGACCCACCT-3’。FAM　　荧光作为报告基因标记探针5’端，TAMRA荧光为淬灭基因标记3’端。逆转录反应20μl，42　　℃反应55min。FQ-PCR反应，逆转录产物5μl，引物400nmol，探针150nmol，dATP、dGTP　　dCTP各200μmol，dUTP 400μmol，TaqDNA酶1.25u。在美国ABI公司生产的7700Sequence de　　tector分析仪上进行分析，每份标本均做C-erbB2和β2-微球蛋白测定。扩增参数为：50℃　　2min，95℃ 10min，94℃ 0.5min，66℃ 1min，35次循环。采用BIECHE的标准曲线制备方　　法，在每次均使用标准品制备标准曲线。根据曲线，仪器自动计算C-erbB2和β2-微球蛋白　　的拷贝数/ml，以C-erbB2和β2-微球蛋白比值作为C-erbB2的表达水平。

　　1.3判定标准临界值：CA15-3为19.3u/ml;CEA为5.0ng/ml;TSGF为64u/ml;TPS为15.8u/L;C-erbB2为C-erbB2/β-actin 1.90，超过临界值为阳性。

　　1.4统计学方法计量数据以(±s)表示，采用SPSS 10.0统计软件，进行t检验，计数资料采用χ2检验。

　　2结果

　　2.1良性乳腺疾病组和乳腺癌组CA15-3、CEA、TSGF、TPS、C-erbB2的测定结果见表1。

　　2.2单项指标对于乳腺癌诊断的评价根据良性对照结果，CA15-3、CEA、TSGF、TPS、C-erbB2对乳腺癌诊断的阳性率分别为51.77%、45.88%、54.12%、38.82%、65.88%，乳腺癌Ⅲ期的阳性率明显高于Ⅰ期(P<0.05)，而不同指标在不同期阳性率不同，且存在假阳性，见表2。表1良性乳腺疾病组和乳腺癌组CA15-3、CEA、TSGF、TPS、C-erbB2测定结果表2单项指标用于乳腺癌诊断的评价

　　2.3联合检测对Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌诊断的评价以上单个肿瘤标志物对乳腺癌诊断阳性率不高，特别是对早期乳腺癌诊断阳性率较低，我们选择阳性率相对较高的标志物进行组合，可以提高Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌诊断的灵敏度。其中以CA15-3、TSGF和C-erbB2联合，其特异性和敏感性与其它三种标志物组合相比差异有显著性(P<0.05)，而与CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2四者组合差异无显著性(P>0.05)，见表3。表3不同标志物联合检测对Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌诊断的评价

　　3讨论

　　目前，关于乳腺癌标志物的研究有很多如：糖类抗原CA15-3、CA125、BCA225、CA27-29;蛋白及肽类抗原乳腺癌特异蛋白、胰岛素样生长因子、雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR);还有基因C-erbB2、EIA、Survivin、CYFRA21-1等[1～3]。临床上用于乳腺癌诊断的标　　志物主要有CA15-3、CEA、TPS、C-erbB2和TSGF等，单独使用灵敏度都比较低，特别是用于早期诊断漏诊率较高。如何提高早期诊断率是目前国内外学者共同关注的问题。CA15-3是从转移性乳腺癌中分离出来的肿瘤抗原，主要存在于乳腺上皮管腔面，当细胞恶变时，血清水平明显升高，也是目前应用最普遍对乳腺癌较为特异的肿瘤标志物。但在早期乳腺癌诊断中，单独使用因灵敏度较低，应用价值不大[4]。TSGF检测是由我国近几年研发，用于体外筛查恶性肿瘤的方法。TSGF的检测有助于发现人体早期或亚临床期恶性肿瘤，检测各种恶性肿瘤，其敏感度为50.0%～91.1%，特异性不低于90%[5]。C-erbB2基因在乳腺癌中扩增率为18%～47%，美国Strectfus报道乳腺癌患者唾液中C-erbB2蛋白含量较正常人高10倍以上，有望用于早期乳腺癌的筛查。邓君等[5]研究31例早期乳腺癌时，发现C-erbB2阳性诊断率为50.6%，明显高于其它常用诊断标志物。针对单项检测指标阳性诊断率较低的特点，许多研究者尝试用多项指标组合以提高阳性诊断率，有人主张高危人群乳腺癌筛查用乳腺癌特异蛋白、TPS和C-erbB2，而对于病情监测和术后早期复发用CEA、CA15-3联合[6]。我们根据目前乳腺癌研究成果，将阳性率较高的几个标志物进行组合，利用ELISA和FQ-PCR方法客观定量分析各指标，发现CA15-3、TSGF和C-erbB2联合诊断早期乳腺癌(Ⅰ期和Ⅱ期)阳性率达76.9%，明显高于单个标志物和其它三指标组合的阳性率(P<0.05)，而与CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2四指标联检出率差异无显著性(P>0.05)，并且特异性达到83.3%，基本满足临床需要。因此要保证较高阳性诊断率，又不增加患者经济负担，CA15-3、CEA、TSGF、C-erbB2三者联合检测值得临床应用。

　　【参考文献】

　　[1]Horiguchi J, Koibuchi Y, Lijima K, et al. Co-expressed type of ERan d HER2 protein asa predictive factor in determining resistance to antiestro-gen therapy in patients with ER-positive and HER2-positive breast cancer [J]. Oncol Rep，2005，14(5)：1109-1116.

　　[2]Giovanella L, Ceriani L, Giardian G, et al. Serum cytokeratin fragment 21.1(CYFRA21.1) as tumor marker for breast cancer: comparison with carbohydrate antigen 15.3(CA15.3) and carcinoembryonic antigen(CEA) [J]. Clin Chem LabMed,2002,40(3):298-303.

　　[3]刘庆涛，于端珍.CA153在乳腺癌诊断及术后监测中的临床应用[J].肿瘤研究与临床，2000,12(5):327-328.

　　[4]孙建国，陈正堂，曹正怀.TSGF检测在恶性肿瘤诊断及疗效观察中的价值[J].第三军医大学学报，2001,23(6)：731-733.

　　[5]邓君，饶绍琴，传良敏.C-ERBB2基因表达和其它肿瘤标志物在乳腺癌诊断中的应用[J].实用医院临床杂志,2006,3(1)：94-95.

　　[6]张品良，邵松.乳腺癌肿瘤标志物[J].山东医药，2006,46(11)：65-67.