三氧化二砷抗肝癌血管新生作用

　　作者：刘琳 作者单位：东南大学附属中大医院肿瘤科，江苏南京 210009

　　【摘要】 目的：　探讨三氧化二砷(As2O3)注射液抗肝癌血管新生的作用及其相关机制。方法： 采用MTT法、透射电镜观察、免疫组化、鸡胚尿囊膜(CAM)血管形成实验等方法，观察As2O3注射液对人肝癌细胞株SMMC7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长、超微结构、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达以及对CAM血管形成的影响。结果： As2O3能显著抑制人肝癌细胞SMMC7721和人脐静脉内皮细胞ECV304生长，用药后诱导其出现了典型的细胞凋亡超微结构改变;As2O3对SMMC7721细胞和ECV304细胞VEGF、 EGFR的表达均有抑制作用;As2O3能抑制CAM血管形成。结论：　As2O3注射液具有显著抗肝癌血管新生作用，其机制与抑制血管内皮细胞生长、诱导血管内皮细胞凋亡、调控肿瘤血管新生相关因子VEGF和EGFR的表达密切相关。

　　【关键词】 三氧化二砷 肝癌 血管生成

　　自20世纪70年代以来，人们已发现肿瘤的生长有赖于血管新生，肿瘤组织中的新生血管不仅为瘤体提供氧分，而且为肿瘤转移及血管浸润提供通道，故血管新生与肿瘤生长、转移密切相关[1]。进一步的研究证实，肝癌为丰富血供实体肿瘤，其生物学特性包括高度血管浸润及转移倾向，并导致该疾病的不良预后。血管新生理论的建立，不仅为深入探讨肝癌的发病机制找到了一条新思路，也为探寻该病的治疗方法提供了新策略[23]。鉴于肝癌是典型的多血管肿瘤，其转移复发与肿瘤血管形成有关，抗肿瘤血管形成治疗对肝癌转移复发的干预有特殊意义。我们已发现三氧化二砷(As2O3)注射液具有抗肝癌作用，其作用机制包括细胞毒、诱导癌细胞凋亡和抑制癌细胞端粒酶活性等[46]。本研究进一步探讨As2O3注射液是否具有抗肝癌血管新生作用，为临床治疗用药奠定实验基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株

　　人肝癌细胞株SMMC7721和建株人脐静脉内皮细胞ECV304，均引自中国科学院上海细胞生物研究所。

　　1.2 药物与试剂

　　0.1%As2O3溶液，即亚砷酸注射液(哈尔滨伊达药业公司产品, 批号 20030801)，使用时以RPMI1640培养液稀释至所需浓度。RPMI1640培养液含10%新生小牛血清和青、链霉素各100×103U·L-1。四甲基偶氮唑蓝(MTT) 购自Fluka公司，用PBS溶液将其稀释至5g·L-1，压滤除菌,4℃避光保存。鼠抗人血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体，为福建迈新生物技术开发公司产品。鸡胚购自南京制药机械厂。M450甲基纤维素为美国Sigma产品。

　　1.3 细胞形态学观察

　　1.3.1 倒置显微镜观察 取对数生长期的细胞按1×109L-1接种于培养瓶中，待细胞完全贴壁后加药处理(As2O3终浓度分别为1、2、4mg·L-1)，对照组加入等体积的培养液，然后培养至预定时间，用倒置显微镜观察细胞生长状况和形态学改变。

　　1.3.2 透射电镜观察 取对数生长期的人脐静脉内皮细胞ECV304按1×109L-1接种于培养瓶中，待细胞完全贴壁后，给药组加入不同浓度的药物，对照组加入等体积的培养液，继续培养。加药后48h收集细胞，4%戊二醛固定2h，0.1mol·L-1磷酸缓冲液漂洗，1%四氧化锇作用后固定，梯度酒精脱水，Epon812包埋剂包埋，切片机切成薄片(切片厚度在50nm左右)，醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜观察。

　　1.4 细胞生长检测

　　取3×107L-1的活细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，设4复孔，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的As2O3溶液，100μl·孔-1，对照孔加入100μl培养液。置于37℃，5%CO2培养箱中培养至预定时间，每孔加入100μl0.04mol·L-1盐酸异丙醇，微型振荡器振荡5～10min使结晶完全溶解，在酶联仪波长570nm处测定各孔吸光度(OD)值，按下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%)=(1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。实验重复3次。

　　1.5 免疫组化检测

　　按SP免疫组化试剂盒说明书操作，观察细胞VEGF和EGFR蛋白的表达情况。

　　1.6 鸡胚尿囊膜(CAM)血管新生

　　取种鸡场孵化的7日龄胚蛋，随机分为2组，每组25只蛋。在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区，划定1cm×1cm圆形开窗位置，在鸡胚气室端钻直径1mm小孔并穿透壳膜。用75%乙醇消毒开窗部位，使用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出CAM，将甲基纤维素碟放置于CAM上血管较少的部位，用微量进样器将各组药物滴入甲基纤维素碟中。处理方法：As2O3组浓度20mg· L-1、阴性对照组用生理盐水，各组滴入量20μl。加药后用无菌透明胶带封窗，放入孵化箱继续孵化。3d后揭去透明胶带，加入适量甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15min。然后以甲基纤维素碟为中心剪取3cm的CAM，放入盛有水的平皿中展开后平铺于滤纸上制成CAM标本。于解剖显微镜下观察用药区血管新生情况。甲基纤维素覆盖区及周围血管形成正常为(-),甲基纤维素覆盖区无血管或血管明显稀少且4mm≤直径≤6mm为阳性(+),直径>6mm为强阳性(++)。根据这一评定标准，计算出经药物作用的CAM血管受到抑制(+)的百分率。

　　1.7 统计学方法

　　采用SAS8.0统计软件，计量资料用方差分析，计数资料用秩和检验,以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察

　　倒置显微镜下观察不同浓度As2O3注射液作用于SMMC7721和ECV304细胞后，用药各组细胞随着药物处理时间的延长，细胞增殖逐渐受到抑制;部分细胞变圆、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，细胞周围出现碎片，部分细胞死亡后漂浮在培养液中。而未加药的对照组细胞呈上皮型贴壁生长，细胞轮廓清楚，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛，见图1。 透射电镜下观察经As2O3注射液作用于SMMC7721和ECV304细胞48h后，镜下均发现大部分细胞出现不同程度的改变，部分细胞呈现退行性改变，胞质中线粒体肿胀、嵴消失、空泡化，胞质疏松，出现大小不一的空泡，基质电子密度降低，内质网扩张，部分细胞胞膜破裂，胞质崩解;或可见细胞凋亡改变，细胞皱缩，胞质浓缩，胞质起泡及凋亡小体形成，细胞核固缩，核内染色质聚集于核膜内侧呈团块或新月状，细胞表面微绒毛减少，甚至消失。未加药对照组细胞胞膜完整，细胞器结构正常，胞质中富含游离核糖体、少量粗面内质网和线粒体，核仁明显，染色质均匀，常染色质丰富，见图2。

　　2.2 As2O3对人肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞生长的影响(MTT法) 应用As2O3注射液后，SMMC7721和ECV304细胞的生长均受到不同程度抑制， 其抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而增强。用不同浓度As2O3注射液作用SMMC7721和ECV304细胞相同时间以及相同As2O3浓度处理不同时间的细胞抑制率相比,均有统计学差异(均P<0.05),见图3、4。

　　2.3 免疫组化分析

　　经2mg·L-1As2O3分别处理SMMC7721细胞和ECV304细胞48 h后，细胞VEGF、EGFR表达均明显下降，利用SAS软件秩和检验分析，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1和图5、6。表1 As2O3对SMMC7721和ECV304细胞VEGF、EGFR蛋白表达的影响

　　2.4 As2O3对CAM血管新生的影响

　　实验结果表明，As2O3注射液对CAM新生血管的形成有抑制作用，用药后新生血管完全抑制或明显减少，而对照组则新生血管正常，毛细血管丰富。两组比较，有显著性差异(P<0.05)，见表2、图7。表2 As2O3对CAM新生血管形成的影响

　　3 讨 论

　　As2O3是传统以毒攻毒类中药砒霜的有效成分。我国学者已率先将As2O3注射液应用于急性早幼粒细胞白血病(APL)的临床治疗，并获得成功[79]。而后，As2O3注射液治疗实体瘤的作用受到了广泛重视，尤其是在肝癌的治疗上取得了突破性进展。近年的研究表明，As2O3可能为多靶点抗肿瘤药，其作用机制包括对肿瘤细胞的原浆毒作用、诱导肿瘤细胞凋亡和分化、抑制肿瘤细胞端粒酶活性、抗肿瘤血管形成等[1012]。在既往研究结果的基础上，本研究中我们继续深入探讨As2O3注射液的抗肝癌作用机制。本研究发现，As2O3注射液具有一定的抗肝癌血管新生作用。本实验中，MTT法和倒置显微镜观察结果均证实，不同浓度的As2O3注射液体外均能抑制人肝癌细胞株SMMC7721和建株人脐静脉内皮细胞ECV304的生长，该抑制作用与药物作用时间和浓度有一定的相关性，即随着作用时间的延长，剂量的增加，其抑制作用不断增强。超微结构观察显示，As2O3注射液可抑制SMMC7721和ECV304细胞生长，并诱导其发生细胞凋亡。CAM技术的研究结果显示，As2O3注射液对CAM新生血管有抑制作用。

　　已有的研究表明，肿瘤血管新生是受多种调控因子诱导的多步骤过程， VEGF和 EGFR是其中关键的两个调控因子[1315]。VEGF表达于血管内皮细胞、肿瘤细胞、某些炎症细胞和间质细胞等，是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，属具有正调控作用的血管生成因子。表皮生长因子(EGF)及其受体也是重要的促血管生成因子，在相当一部分肿瘤中存在高表达。华海清等[16]的实验表明,As2O3能降低裸鼠人肝癌移植瘤VEGF的表达。本实验结果表明，人肝癌细胞SMMC7721和人脐静脉内皮细胞ECV304均高表达VEGF和EGFR，而经As2O3注射液处理后，明显下调两株细胞VEGF和EGFR的表达。考虑此为As2O3抗肿瘤血管新生作用的分子机制之一。

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