DNMT3B基因启动子C46359T多态性与食管癌易感性的关联分析

　　作者：刘东声 作者单位：东南大学 发育与疾病相关基因教育部重点实验室，江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的： 探讨DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性与江苏汉族人群食管癌易感性的关系。方法： 提取195例食管癌患者及189例健康体检人员外周血基因组DNA，采用PCRRFLP结合DNA测序技术检测DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性。结果：　正常对照DNMT3B C46359T等位基因TT/CT基因型频率为98.9%/1.1%,病例组为97.9%/2.1%，在对照组与病例组中均未检测到DNMT3B 46359 CC基因型。携带DNMT3B 46359 CT等位基因的个体与对照组相比，其患食管癌的易感性未见明显升高(P=0.43,OR=1.96，95%CI：0.35～10.82)。对比江苏汉族人群和英国、美国白种人群，DNMT3B C46359T单核苷酸多态性频率分布有明显差异(P<0.01)。 结论： DNMT3B 基因C46359T多态性可能不适合作为中国汉族人群食管癌易感性的一个独立风险因素，此位点多态性的分布在不同人种间有显著差异。

　　【关键词】 DNA甲基转移酶3B 食管癌 单核苷酸多态性

　　肿瘤的病因学，尤其是其与某些遗传性疾患关系的研究已表明,大多数人类恶性肿瘤是由环境因素作用于遗传物质的结果[1]，遗传因素越来越被认为是癌症发病风险的主要因素之一[23]。尽管有些基因突变可以导致肿瘤，但是对于大多数人来说，患肿瘤的风险可能来自于相对常见的低外显率的疾病相关多态性的差异[3]。肿瘤不仅是遗传性疾病，同时也是由基因转录沉默所引起的表观遗传性疾病。在一些人类肿瘤细胞中，启动子区CpG岛的重新甲基化可能是肿瘤抑制基因失活的机制[4]。DNA甲基化的异常是最常见的表观遗传学改变，DNA甲基化是由一组DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)家族催化的，目前在哺乳动物中确定的DNMT有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B[57]。其中，DNMT1主要负责维持甲基化，而DNMT3A和DNMT3B主要负责重新甲基化[6，8]。DNMT3B在肿瘤形成过程中起重要作用，已经发现在肿瘤细胞中存在DNMT3B的高表达 [5]。DNMT3B基因定位于20号染色体q11.2，在距转录起始位点-149碱基对的启动子区含有C→T转换多态性(C46359T)，体外实验表明，该位点的转换可以使DNMT3B启动子的活性增加30% [9]。

　　食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在发展中国家居第5位，我国的食管癌死亡率居世界首位[10]。早期食管癌经手术切除后5年生存率可达90%以上，而中晚期患者仅为6%～15%[1112]。如果能够做到早期诊断或易感风险评估，则有可能降低食管癌的死亡率。本研究选择江苏地区汉族人群，探讨DNMT3B基因C46359T位点基因多态性与该地区人群食管癌遗传易感性之间的关联。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　病例组选自2007年2月～2007年7月在江苏省肿瘤医院、南京军区南京总医院保存的食管癌病人血液样本195例，其中男153例，女42例，所有病例临床资料完整。血液标本采集前均未有抗肿瘤药物使用记录。对照组为健康人血液样本189例，其中性别、年龄等均与病例组相匹配，男135例，女54例, 见表1。两组人群均系江苏地区汉族人群，个体之间均无血缘关系。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA抽提 采集静脉全血2ml，乙二胺四乙酸二钾(EDTAK2)抗凝，常规蛋白酶K消化后苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀法提取基因组DNA[6]，总共提取食管癌患者、健康正常人外周血 DNA 384例，提取的DNA溶解于pH8.0 TE中，4℃保存。表1 病例组与对照组样本间年龄和性别分布频率比较例 注：括弧中为所占百分比1.2.2 PCR PCR引物序列见文献[13]，上游5′TGCTGTGACAGGCAGAGCAG3′(nt 46151–46170)，下游5′GGTAGCCGGGAACTCCACGG3′(nt 46530–46511)，扩增产物380bp。25μl反应体系含dNTPs 0.1mmol·L-1，上下游引物各10pmol，Taq DNA聚合酶1.25U，DNA1.0μl(100ng)，MgC122.0mmol·L-1。95℃预变性5min;95℃30s，69℃30s，共32个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察。

　　1.2.3 限制性内切酶BlnⅠ酶切反应 20μl酶切反应体系含10×K Buffer 2.0μl，BlnⅠ(TaKaRa公司) 4U，PCR产物2.0μl，混匀后37℃水浴中酶切过夜。酶切产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。

　　1.2.4 DNA序列测定 选择凝胶电泳证实为CT基因型、TT基因型各2例，由南京金思特公司经双脱氧链终止法测序。

　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行卡方检验，计算P值、OR值和95%CI。

　　2 结 果

　　2.1 一般资料的统计学检验

　　经双侧卡方检验，在病例与对照组中，年龄在40～60岁和>60岁的分别为60.0%/39.5% 和49.2%/50.3%，男、女分别为78.5%/21.5% 和71.4%/28.6%，均无统计学差异(P>0.05)，见表1。

　　2.2 DNMT3B启动子C46359T PCR产物分析

　　PCR产物为380bp的片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果见图1。经限制性内切酶BlnⅠ酶切后，当nt46359处为T时，BlnⅠ可将PCR产物切为207bp和173bp两个片段;当nt46359处为C时，BlnⅠ不能将PCR产物切开，只有1个380bp的片段;当nt46359处为CT时，为380bp、207bp和173bp3个片段，见图2。为证实酶切结果，将凝胶电泳证实为CT基因型、TT基因型各2例PCR产物送至测序公司(南京金思特公司)进行测序，其中箭头所示为DNMT3B启动子C46359T多态性位点，见图3。

　　2.3 DNMT3B C46359T等位基因频率在病例组和对照组中的分布 经HardyWeinberg遗传平衡吻合度检验，病例和对照组的基因型分布符合遗传平衡定律。结果显示，正常对照中DNMT3B C46359T等位基因TT/CT基因型频率为98.9%/1.1%, T的频率为99.47%，C的频率为0.53%;病例组中TT/CT基因型频率为97.9%/2.1%,T 频率为98.97%， C的频率为1.03%。经χ2检验，DNMT3B C46359T等位基因TT/CT基因型频率在正常人群和食管癌患者中分布差异没有显著性(P=0.43)，对照组与病例组中均未检测到DNMT3B 46359 CC基因型。见表2。 注：括弧中为所占百分比2.4 DNMT3B C46359T等位基因频率在中国汉族人和英国、美国白种人中的分布 经与文献报道的DNMT3B C46359T等位基因频率分别在英国和美国白种人[9，14]之间比较，显示英国、美国白种人中TT、CT和CC基因型分别占23.2%/45.0%/31.8%和23.2%/41.8%/35%，而中国汉族人TT和CT基因型分别为98.9%和1.1%，中国汉族人DNMT3B C46359T等位基因频率分布与英、美两国白种人存在显著的统计学差异(P<0.01)，见表3。

　　3 讨 论

　　单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率大于1%,是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上[15]。SNP与肿瘤等许多疾病的易感性有关[16]。研究表明，位于基因启动子区的SNP能影响基因的表达或酶的活性[1314]。DNA甲基化在胚胎发育和印迹基因的转录抑制，如X染色体的失活以及许多人类肿瘤中重要基因的异常沉默中起重要作用[17]。DNMT3B基因启动子区-149位C46359T多态性与乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌以及急性白血病等多种肿瘤易感性有关[9，14，1820]。这些研究提示该位点的遗传变异可能与多种肿瘤发病风险相关，该位点可能作为评价人群肿瘤易感性的一个指标。到目前为止，C46359T是否与食管癌易感性有关尚不清楚。表3 DNMT3B 基因启动子区 C46359T等位基因频率注：括弧中为所占百分比食管癌是我国常见的一种消化道肿瘤，因其缺乏有效的早期诊断指标，当患者出现症状时往往为中晚期，不利于治疗，且预后不良。为了给食管癌提供一个早期诊断指标，我们对DNMT3B基因启动子区上游149位C46359T多态性与食管癌的易感性进行了研究。本研究所得DNMT3B基因启动子区-149位点基因型分布结果符合HardyWeinberg平衡定律。正常对照组中TT基因型为98.9%，CT基因型为1.1%，病例组中分别为97.9%和2.1%，两者无显著的统计学差异(P=0.43,OR=1.96，95%CI为0.35～10.82)。这说明至少在我们的研究中，DNMT3B基因启动子区上游149位C46359T多态性与食管癌易感性之间可能无显著的相关性。这有可能是由于在不同的细胞组织中DNMT3B的不同剪切子催化活性有差异[8]，或者是DNMT3B活性的抑制不能使一些细胞系中高甲基化的肿瘤抑制基因激活[2122]，而且在不同肿瘤中，C和T所代表的风险因素也不同，如在肺癌中，DNMT3B C46359T的CT+TT基因型所患风险几乎是CC基因型的两倍[20];而在乳腺癌中，CT+CC基因型风险率显著高于TT基因型[9]，这说明在不同的肿瘤中DNMTs作用的复杂性。本研究结果还显示中国汉族人的基因型分布与英国、美国白种人有显著不同(P<0.01)。有关中国人群该位点的研究结果发现，此CT基因型在中国汉族为2.5%[16],北方地区为5.1%[19]，正常对照组中均未检出CC基因型，这种分布的显著差异的机制还没有明确。DNMT3B多态性的生物学功能，以及其在肿瘤发生过程中的作用还有待进一步研究。此位点与食管癌易感性的相关性还需要在其他种族中进行研究。

　　【参考文献】

　　[1]吕宝忠,赵寿元.肿瘤遗传学[M].北京：科学出版社，1998：98.

　　[2]WEBER B L, NATHANSON K L. Low penetrance genes associated with increased risk for breast cancer[J]. Eur J Cancer,2000,36(10):11931199.

　　[3]PONDER B A. Cancer genetics[J].Nature, 2001,411(6835):336341.

　　[4]ENG C, HERMAN J G, BAYLIN S B. A bird’s eye view of global methylation[J]. Nat Getet,2000,24(2):101102.

　　[5]ROBERTSON K D, KEYOMARSI K, GONZALES F A, et al. Differential mRNA expression of the human DNA methyltransferase (DNMTs) 1,3a and 3b during the G0/G1 to S phase transition in normal and tumor cells[J]. Nucleic Acids Res, 2000,28(10):21082113.

　　[6]MIZUNO S, CHIJIWA T, OKAMURA T, et al. Expression of DNA methyltransferases DNMT1, 3A, and 3B in normal hematopoiesis and in acute and chronic myelogenous leukemia[J]. Blood,2001,97(5):11721179.

　　[7]LIU K,WANG Y F. Endogenous assays of DNA methyltransferases: evidence for differential activities of DNMT1, DNMT2, and DNMT3 in mammalian cells in vivo[J]. Mol Cell Biol,2003,23(8):27092719.

　　[8]OKANO M, BELL D W, HABER D A, et al. DNA methyltransferases Dnmt 3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development[J]. Cell,1999,99(3):247257.

　　[9]MONTGOMERY K G, LIU M C, ECCLES D M ，et al. The DNMT3B C→T promoter polymorphism and risk of breast cancer in a British population：a ease—control study[J]. Breast Cancer Res，2004,6(4)：390394.

　　[10]饶克勤，李连弟.中国恶性肿瘤危险因素研究[M].北京：中国协和医科大学出版社,2003:235248.

　　[11]WANG L D，ZHENG S，ZHENG Z Y，et al.Primary adenocarcinomas of lower esophagus，esophagogastric junction and gastric cardia：in special reference to China[J].World J Gastroenterol，2003，9(6)：11561164.

　　[12]MORETO M.Diagnosis of esophagogastric tumors[J].Endoscopy，2003，35(1)：36.

　　[13]SKOOG T，vant HOOFT F M，KALLIN B，et al. A common functional polymorphism (C→A substitution at position863)in the promoter region of the tumour necrosis factor alpha (TNFalpha) gene associated with reduced circulating levels of TNFalpha[J].Hum Mol Genet,1999 8(8)：14431449.

　　[14]SHEN H, WANG L, SPITZ M R, et al. A novel polymorphism in human cytosine DNAmethyltransferase3B promoter is associated with an increased risk of lung cancer[J].Cancer Res, 2002, 62(17):49924995.

　　[15]COLLINS F S，BROOKS L D，CHAKRAVARTI A.A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation[J]. Genome Res，1998,8(12)：12291231.

　　[16]COLLINS A，LONJOU C，MORTON N E，et al.Genetic epidemiology of single—nucleotide polymorphisms[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(26)：1517315177.

　　[17]JONES P A, TAKAI D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics[J]. Science, 2001, 293: 10681070.

　　[18]李渊,戴悦,武淑兰,等.DNMT3B基因启动子单核苷酸多态性C46359T与急性白血病的关系[J].中华内科杂志,2005,44(8):588591.

　　[19]WANG Y M, WANG R, WEN D G,et al. Single nucleotide polymorphism in DNA methyltransferase 3B promoter and its association with gastric cardiac adenocarcinoma in North China[J]. World J Gastroenterol,2005,11(23):36233627

　　[20]LEE S J, JEON H S, JANG J S ,et al. DNMT3B polymorphisms and risk of primary lung cancer[J].Carcinogenesis,2005,26(2): 403409.

　　[21]SOEJIMA K，FANG W, ROLLINS B J. DNA methyltransferase 3b contributes to oncogenic transformation induced by SV40T antigen and activated ras[J]. Oncogene,2003,22(30): 47234733.

　　[22]WEISENBERGER D J,VELICESCU M, CHENG J C, et al.

　　Role of the DNA methyltransferase variant DNMT3b3 in DNA methylation[J]. Mol Cancer Res,2004,2(1): 6272