靶向LIMK1的siRNA 真核表达载体（pSUPERLIMK1）的构建、鉴定及在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达

　　作者：邢志军 王岩 高忠礼 作者单位：(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

　　【摘要】 目的 构建靶向人LIMK1的siRNA 真核表达载体(pSUPERLIMK1)并检测其在人成骨肉瘤MG63细胞中进行表达。方法 将设计的LIMK1的siRNA的寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接，构建重组pSUPERLIMK1真核表达载体，并将其转染入MG63细胞株中。采用RTPCR检测pSUPERLIMK1质粒转染后LIMK1在人成骨肉瘤中的基因表达,Western blot检测LIMK1蛋白的表达。结果 构建的真核表达载体pSUPERLIMK1可在人成骨肉瘤MG63细胞中的表达。结论 构建的人LIMK1siRNA蛋白的真核表达载体pSUPERLIMK1,为进一步骨肉瘤基因靶向治疗的研究奠定了基础。

　　【关键词】 LIMK1;siRNA;真核表达载体

　　近年来的研究表明，肌动蛋白骨架是促进肿瘤细胞运动、诱发肿瘤恶化(侵袭、转移)的重要因素〔1,2〕。单丝氨酸蛋白激酶LIMK1(LIM kinase1)是LIMK(LIM kinase)基因家族的成员之一，主要包含LIM和PDZ蛋白和蛋白相互作用区、P/S结构域、激酶结构域，主要生物学功能是通过磷酸化肌动蛋白特异解聚因子丝切因子/cofilin而使其失活，继而抑制纤丝状肌动蛋白的聚合，影响肌动蛋白的稳定，参与肌动蛋白细胞骨架的重组，在各种细胞的运动、分裂和结构形成中发挥着不可替代的作用〔3,4〕。siRNA 技术是一种新的基因治疗技术，能有效、特异地抑制细胞内基因的表达〔5〕。本研究中我们设计了LIMK1特异性siRNA，在体外构建LIMK1siRNA真核表达载体，旨在为以LIMK1为靶点的骨肉瘤基因的治疗奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人成骨肉瘤细胞株MG63细胞购于上海中国科学院细胞研究所;空载体pSUPER由吉林大学病理生物学教育部重点实验室王岩教授惠赠;大肠杆菌 DH5α感受态细胞购于天根生化科技(北京)有限公司;质粒小提、大提试剂盒，限制性内切酶 BamH I、BglⅡ、Hind III、Xho1、T4 DNA 连接酶，Taq DNA 聚合酶，DL2000 DNA Marker，T4 DNA Ligase为日本TAKARA公司产品;OptiMEM为美国Gibico公司产品;Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司;抗LIMK1(H84)抗体购自美国Santa Cruz公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 靶向LIMK1的siRNA序列设计 依据NCBI 数据库中LIMK1的mRNA全序列Homo sapiens LIM domain kinase 1 (LIMK1)( NM_002314.2)，根据siRNA 设计原则合成了3对LIMK1的siRNA的寡聚脱氧核苷酸链(oligo)(LY1、LY2、LY3)(Invitrogen)，经BLAST Search 检索确认与LIMK1以外的人类已知基因序列无同源性。从5′端到3′端依次为BglⅡ酶切位点、由19个碱基组成的靶序列、茎环结构、能与靶序列结合的互补序列、转录终止子、Hind Ⅲ酶切位点等六个区域(BglⅡ+ Sense + Loop +Antisense + 终止信号+Hind Ⅲ)，同时以pSUPER空载体作为阴性对照。oligo序列见表1。

　　表1 寡聚脱氧核苷酸链(oligo)序列(略)

　　1.2.2 siRNA真核表达载体的构建及鉴定 将合成的正向和反向片段溶解于灭菌水中混合进行退火反应，退火后形成的双链DNA与经BglⅡ和HindⅢ酶切并回收纯化后的pSUPER质粒连接过夜。然后转化入大肠杆菌 DH5α，挑选氨苄青霉素抗性菌落扩增培养，然后小量制备质粒并测序(天根生化科技有限公司测序)。继续扩增并抽提构建好的质粒载体使用pSUPER 载体中的酶切位点EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用Kodak电泳凝胶观察系统扫描。

　　1.2.3 细胞培养及pSUPERLIMK1质粒转染 MG63细胞培养在含10%胎牛血清、100 U/ml氨苄青霉素及100 U/ml链霉素的HDMEM培养基中，37℃、饱和湿度、5 %CO2浓度下培养，1～2 d换液1次。实验取对数生长期细胞按Lipofectamine 2000 试剂说明，于转染前1 d胰酶消化收集培养的MG63细胞，使其在转染日密度达95%，10%胎牛血清的 HDMEM培养;转染日每孔8.0 μg质粒DNA 稀释到 500 μl OptiMEM中;500 μl OptiMEM稀释20 μl Lipofectamine 2 000试剂，稀释后室温放置5 min;将稀释的质粒DNA和Lipofectamine 2000混合，在室温放置20 min形成转染复合物;用PBS轻柔洗3遍贴壁细胞后，加入5 ml OptiMEM，每孔加入1 ml转染复合物。4 h之后换10%胎牛血清的HDMEM中。

　　1.2.4 pSUPERLIMK1质粒转染后MG63细胞中LIMK1蛋白表达检测 转染后 48 h收集细胞，提取总蛋白，制作蛋白标准曲线，计算蛋白浓度。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测LIMK1蛋白的变化，用8%SDSPAGE进行凝胶电泳，湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，以1∶1 000加入兔抗人LIMK1一抗，4 ℃过夜，TBST洗膜30 min，以1∶1 000加入羊抗兔二抗，37℃1 h，TBST洗膜30 min后用ECL检测试剂室温反应1 min，然后显影、成像。扫描仪扫描后用ImageJ图像分析软件对所得条带进行定量分析。

　　1.2.5 pSUPERLIMK1质粒转染后MG63细胞中LIMK1 mRNA的变化 转染后24 h，用 Trizol裂解液裂解细胞，提取细胞中的总 RNA，用 DEPC稀释后测浓度并计算RNA含量，用RTPCR试剂盒先将RNA逆转录为cDNA，再加入上下游引物进行PCR扩增(表2)。扩增结束后取最终产物进行1.5%的琼脂糖凝胶(含EB0.5 μg/ml)电泳，采用kodak电泳凝胶观察系统 EDAS120扫描。

　　表2 PCR引物设计及反应条件(略)

　　2 结果

　　2.1 靶向LIMK1的 siRNA 真核表达载体的鉴定 将重组质粒 pSUPERLIMK1进行序列分析，测序结果正确。进一步将重组质粒用BamH1和Xho1进行双酶切后，琼脂糖电泳鉴定结果见图1。重组质粒经酶切后电泳，观察到在300 bp左右各有一条带，符合空载体pSUPER 酶切位点间长度248 bp及LY13插入的siRNA 64 bp片段的特征。

　　1 λ/Pst1 Marker，2 空质粒，3～5分别对应Y1～Y3号质粒

　　图1 质粒连接后双酶切电泳图谱(略)

　　2.2 Western blot结果 Western blot检测发现，转染LY3号质粒的细胞中LIMK1蛋白表达明显下调，抑制率约达到70%;转染LY1及LY2号质粒的细胞与未作处理细胞目的蛋白表达无明显差异(图2)。

　　图2 Western印迹法检测转染后细胞中蛋白表达变化(略)

　　2.3 RTPCR结果 RTPCR检测发现，转染pSUPERLIMK1(LY3)质粒的细胞中LIMK1基因表达明显下调，说明转染pSUPERLIMK1质粒后，明显沉默了LIMK1基因在人成骨肉瘤细胞中的表达(图3)。

　　图3 转染pSUPERLIMK1质粒后LIMK1在人成骨肉瘤中的基因表达情况(略)

　　3 讨论

　　外源导入双链 RNA(dsRNA)可触发细胞内同源 mRNA 的特异性降解，进而使该基因表达沉默，这种现象被称为 RNA 干扰(RNA interference，RNAi)。RNAi 现象广泛存在于自然界，在哺乳动物体内，体外导入的 siRNA 可模拟 dsRNA 的体内切割产物，能特异性抑制细胞内同源基因的表达〔6〕。

　　近年来LIMK1在肿瘤发生中的意义引起了广泛关注，有研究发现人类乳腺癌细胞中LIMK1在调节溶酶体和内涵体(endosome)的囊泡运输中起着重要作用〔7〕。另有报道，LIMK1在前列腺肿瘤和前列腺癌细胞株中有过度表达，并且转移的前列腺癌细胞中也有高浓度磷酸化的cofilin;抑制LIMK1 后能使细胞静止在G /M期，从而改变细胞增殖、细胞形态，遏制转移性前列腺癌细胞的侵袭性〔8〕 。同时，研究也发现前列腺癌中与转移相关的染色体基因位点在7ql1.2，而人类LIMK1基因也定位在7ql 1.23，提示两者具有相关性。可见，LIMK1对肿瘤细胞的分裂和侵袭性起着重要的调节作用，它可能是引起肿瘤细胞侵袭和转移的关键调节分子之一。

　　本研究根据LIMK1基因设计shRNAs干扰序列，经体外转录合成、脂质体转染最终成功筛选出1条针对LIMK1有明显干涉效果的shRNA序列，将序列构建到pSUPER质粒中，所构建的LIMK1siRNA表达载体转染骨肉瘤细胞后，其转录产物在 Dicer 的作用下产生发卡状的LIMK1siRNA，进而特异性导致LIMK1 mRNA 降解，有效的沉默了LIMK1在人成骨肉瘤细胞MG63中的基因表达及蛋白表达，为以LIMK1为靶点的骨肉瘤基因治疗的后续研究奠定了基础。

　　【参考文献】

　　1 Yamazaki D,Kurisu S,Takenawa T.Regulation of cancer cell motilitythrough actin reorganization〔J〕.Cancer Sci,2005;96(7):379.

　　2 Kamai T,Tsujii T,Arai K，et al.Significant association of Rho/ROCKpathwaywith invasion and metastasis of bladder cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2003;9(7):2632.

　　3 Davila M，Frost AR，Wassermann K，et al.LIM kinase 1 is essential for the invasive growth of prostate epithelial cells: implications in prostate cancer〔J〕.J Biol Chem，2003;278(38): 3686875.

　　4 Takahashi H，Funakoshi H，Ali AA，et al.LIMkinase as a regulator of actin dynamics in spermatogenesis〔J〕.Cytogenet Genome Res，2003;103(34):2908.

　　5 Chavarria T, Valenciano AI, Heape M，et al.Differential, agedependent MEKERK and PI3KAkt activation by insulin acting as a survival factor during embryonic retinal development〔J〕.Dev Neurobiol,2007;67(13):177788.

　　6 Elbashir SM，Harborth J，Tintut Y，et al.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature，2001;411(6836):4948.

　　7 Bominaar AA,van Haastert PJ.Phospholipase C in Dictyostelium discoideum.Identification of stimulatory and inhibitory surface receptors and Gproteins〔J〕.Biochem J，1994;297(Pt1):18993.

　　8 Nishimura Y，Yoshioka K，Bernard O，et al.LIM kinase 1: evidence for a role in the regulation of intracellular vesicle trafficking of lysosomes and endosomes in human breast cancer cells〔J〕.Eur J Cell Biol，2004;83(7):36980.