FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附的影响

　　作者：黄照权，刘飞，黄培林，李楠，徐佳佳，吴鹏 作者单位：右江民族医学院附属医院，广西百色533000;东南大学附属南京第二医院肿瘤科，江苏南京210003;东南大学医学院病理学系，江苏南京210009

　　【摘要】目的 探讨FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附能力的影响。方法 将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT转染FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45，分别用MTT法、平板克隆形成实验、黏附实验检测转染前后细胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的变化。结果 FHIT基因的过表达可降低MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力(P<0.05)，但是对MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。结论 FHIT基因过表达可抑制人胃癌细胞系MKN-45的增殖和克隆形成，对于MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。

　　【关键词】 FHIT 胃肿瘤 细胞增殖 克隆 分子 基因 转染 细胞粘附

　　FHIT gene over-expression impacts on proliferation and adhesion of human gastric cancer cell line MKN-45

　　HUANG Zhao-quan, LIU Fei, HUANG Pei-lin, LI Nan, XU Jia-jia, WU Peng

　　(Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, China;Department of Oncology, the Second Hospital of Nanjing, Affiliated toSoutheast University, Nanjing, Jiangsu 210003, China; Department of Pathology, Medical College of Southeast University, Nanjing, Jiangsu 210009, China)

　　Abstract: Objective To evaluate the effects of FHIT gene over-expression on human gastric cancer cell line MKN-45 proliferation and adhesion. Methods Human xenogenous eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-FHIT were transfected to mRNA-negative human gastric cell line MKN-45. A MTT assay, plate clony-forming test and adhesion test were performed to assess the MKN-45 cells' proliferative activity, clony-forming capability and adhesive ability before and after transfection. Results FHIT over-expression can reduce MKN-45 cells' proliferation and clony-forming capability (P<0.05), but it was ineffectiveness on MKN-45 cells and endothelial cells adhesion. Conclusion FHIT over-expression can inhibit the proliferation and clony-forming ability of human gastric cell line MKN-45, it dose not work on MKN-45 cells and endothelial cells adhesive ability.

　　Key words: FHIT; gastric neoplasms; cell proliferation; cloning, molecular; genes; transfection; cell adhesion

　　胃癌的发生已被公认是一个多基因、多步骤过程，涉及ras、p27等癌基因，p53、APC等抑癌基因，但完整的胃癌发生基因谱仍不清楚。脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad, FHIT)基因是Ohta等于1996年从上皮癌细胞系3p14.2区域克隆出的一个候选抑癌基因，该基因在所有检测过的人正常组织中都表达;但在多种肿瘤组织和细胞系中，FHIT基因结构及表达异常[1～3]。我们将成功构建的含FHIT基因的真核表达载体pcDNA3.1-FHIT转染至人胃癌细胞系MKN-45中，得到稳定的过表达，观察转染前后MKN-45细胞系增殖、克隆形成、细胞粘附等方面生物学行为的变化，以探讨FHIT基因对胃癌的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞系和材料 　　人低分化胃腺癌细胞系MKN-45、人脐静脉内皮细胞系ECV304，由东南大学临床医学院中心实验室馈赠。真核表达质粒pcDNA3.1购自Invitrogen公司。

　　1.1.2 主要试剂 RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，脂质体Lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司。二甲基亚砜购自上海凌峰化学试剂有限公司，MTT购自Promega公司，其它生化试剂均为分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 人低分化胃腺癌细胞系MKN-45、人脐静脉内皮细胞系ECV304，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，培养液为含10%小牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的RPMI1640。

　　1.2.2 真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT的转染 参照说明书，用lipofectamine 2000将真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT转染至FHIT基因mRNA阴性表达的人胃癌细胞系MKN-45。转染后采用G418筛选阳性克隆，并且继续培养。用RT-PCR法检测FHIT基因mRNA的表达。转染组细胞有目的基因条带出现，而转染空质粒组和阴性对照组均无目的条带出现，证明转染成功。

　　1.2.3 MTT法检测细胞增殖活性 分别收集空白对照组、pcDNA3.1转染组和pcDNA3.1-FHIT转染组处于对数期的细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔。置37℃，5%CO2培养箱培养使细胞贴壁。根据不同组别，12、36、60、84h后检测细胞活性。检测时小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次弃上清。每孔加入180μl新鲜RPMI1640培养液，再加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm或570nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。以OD值为纵坐标，以时间(h)为横坐标，绘制生长曲线。

　　1.2.4 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 　　分别收集空白对照组、pcDNA3.1转染组和pcDNA3.1-FHIT转染组细胞接种在6孔板上，每孔为200个细胞，常规培养20天后姬姆萨染色。冲洗染色液，观察各平皿细胞克隆的形成数量。

　　1.2.5 黏附实验检测细胞粘附能力变化 　　培养的人脐静脉内皮细胞系ECV304经PBS洗涤两次，接种于96孔板。待内皮304细胞长满96孔板，弃去培养液，PBS洗涤一次。将分别收集的空白对照组、pcDNA3.1转染组和pcDNA3.1-FHIT转染组细胞5×104个/孔接种其上。将96孔板放入37℃，5%CO2培养箱培养45min。PBS洗涤两次，弃去未被吸附的内皮304细胞。加入0.25% Rose Bergal，100μl/孔，室温放置5min，PBS洗涤两次。加入95%乙醇，200μl/孔, 室温30min，570nm测光密度值。细胞吸光率=总吸光率-内皮细胞吸光率。实验重复三遍。

　　1.3 统计学分析 计量资料以±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析均数间差别多重比较的LSD(Least significant difference)检验。统计结果的图形化由Excel 2000绘图程序完成。

　　2 结果

　　2.1 重组质粒pcDNA3.1-FHIT转染MKN-45细胞后FHIT基因mRNA的表达情况 pcDNA3.1-FHIT-MKN45细胞有462bp大小的目的基因条带出现，而pcDNA3.1- MKN-45细胞和MKN-45细胞均无目的条带出现(见图1)。

　　2.2 FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖能力的影响 　　随着细胞培养时间的逐渐延长，pcDNA3.1-FHIT转染组细胞的生长曲线增长幅度较pcDNA3.1空质粒转染组及空白对照组细胞降低(见图2)。细胞生长至84h，pcDNA3.1-FHIT转染组细胞生长曲线明显低于pcDNA3.1空质粒转染组和空白对照组(P<0.05)。而空白对照组和pcDNA3.1空质粒转染组间差异无显著性(P>0.05)。 见表1。

　　2.3 FHIT基因过表达对MKN-45细胞平板克隆形成能力的影响 图3可见pcDNA3.1-FHIT转染组细胞克隆形成能力低于pcDNA3.1空质粒转染组和空白对照组(P均<0.05)。而空白对照组和pcDNA3.1空质粒转染组间差异无显著性(P>0.05)。

　　2.4 FHIT基因过表达对MKN-45细胞与内皮细胞间粘附能力的影响 各组之间吸光度值差异无显著性(P>0.05)，提示FHIT基因过表达对MKN- 45细胞与内皮细胞间粘附能力无明显影响，见表2。

　　图1 转染MKN细胞后RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图(略)

　　1.pcDNA3.1-FHIT转染组;2.pcDNA3.1空质粒转染组;3.阴性对照组;4.100bpDNA Ladder

　　表1 FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖的影响(略)

　　a：P<0.05。pcDNA3.1-FHIT转染组与pcDNA3.1空质粒转染组和空白对照组相比差异有显著性

　　图2 FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖能力的影响(略)

　　表2 FHIT基因过表达对MKN-45细胞与内皮细胞粘附能力的影响(略)

　　a.空白对照组; b.pcDNA3.1空质粒转染组; c.pcDNA3.1-FHIT转染组

　　图3 FHIT基因过表达对MKN-45细胞增殖能力的影响(略)

　　3 讨论

　　Guo等[4]认为FHIT基因与肿瘤细胞增殖及周期无关。但Pichiorri F等[5]认为FHIT可通过依赖caspase途径的凋亡而抑制细胞生长，Yoshihito N等[6]的研究认为，FHIT基因可通过抑制IκB-α的磷酸化进而阻断NF-κB信号通路而起到抑癌作用。FHIT的激活可通过调控细胞P53凋亡因子的作用而影响肿瘤细胞增殖。我们将pcDNA3.1-FHIT转染至FHIT基因mRNA阴性表达的人胃癌细胞系MKN-45，使其FHIT基因过表达后，MKN-45细胞生长曲线增长幅度较空白对照组及pcDNA3.1空质粒转染组低。实验结果提示FHIT基因过表达可使MKN-45细胞的增殖活性受到抑制，这表明FHIT基因的表达水平可影响到胃癌细胞的增殖活性，该基因可能参与癌细胞增殖的负性调控。FHIT基因在体内和体外均有抑制MEC-1细胞增殖和成瘤性的功能，可降低细胞的分化程度[7]。关于FHIT基因抑制肿瘤细胞增殖的机制，目前认为FHIT基因主要通过其产物FHIT蛋白参与Ap3A的代谢及AMP2酶介导的细胞信号形成，从而阻滞细胞增殖。Ren CC等[8]认为 FHIT 蛋白是一种典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，能区域特异性地水解ApnA(n=3-6) 成为ADP和AMP。FHIT蛋白水解酶活性丧失导致Ap3A水平升高，Ap3A 是ATP的类似物，能抑制蛋白激酶的活性。Ap3A水平升高则增强了生长信号转导途径，阻断抑制途径和凋亡途径，参与肿瘤的发生。也有研究认为Ap3A是哺乳动物细胞中的一种第二信使，并可导致细胞周期的阻滞。但Wali A等[9]认为FHIT蛋白的抑制肿瘤作用与Ap3A水解酶活性无关，而可能主要依赖FHIT蛋白与底物或其它相关接头分子的结合。他们把突变型FHIT基因转染到FHIT缺陷的肿瘤细胞中，发现编码产物虽无Ap3A水解酶活性，却同样能抑制肿瘤细胞在裸鼠体内的成瘤作用。

　　克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。通过计数克隆形成数，可了解细胞的增殖力和对生存环境的适应能力。本实验结果提示：FHIT基因过表达后，MKN-45细胞的平板克隆形成能力低于pcDNA3.1空质粒转染组和空白对照组(P均<0.05)，而空白对照组和pcDNA3.1空质粒转染组间差异无显著性。这表明FHIT基因可能对胃癌细胞系的克隆形成能力有一定的影响。

　　肿瘤转移是一个多阶段的复杂过程，粘附是肿瘤侵袭和转移的始动因素。粘附导致肿瘤细胞在脉管内聚集及穿出管壁向远隔组织转移。肿瘤细胞与内皮细胞间的粘附是其穿出脉管的第一步，主要通过肿瘤细胞上的整合素与内皮细胞结合。介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(Extra celluar Matrix，ECM)间相互粘附的为细胞粘附分子(Cell adhesion Molecules，CAMs)。CAMs存在于细胞膜表面或ECM中的跨膜糖蛋白，它们通常以配体和受体相结合的方式而发挥作用。其基本功能是介导细胞粘附，同时参与细胞的信号转导与活化、细胞的生长及分化、炎症、肿瘤转移等一系列重要生理和病理过程。我们通过肿瘤细胞体外粘附实验模型，来检测FHIT基因的转染对人胃癌细胞系MKN-45细胞与内皮细胞粘附能力的影响，结果显示FHIT基因过表达对于MKN-45与内皮细胞的粘附能力没有明显的影响，FHIT基因可能通过别的途径影响肿瘤细胞的转移。

　　综上所述，我们将pcDNA3.1-FHIT转染至FHIT基因阴性表达的MKN-45细胞使其过表达FHIT基因。比较转染前后MKN-45细胞生物学行为的改变，结果显示FHIT基因的过表达使得MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力受抑制，提示FHIT基因在胃癌的发生、发展中起着一定的作用，但具体机制尚需进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[5] Pichiorri F, Trapasso F, Palumbo T, et al. Preclinical assessment of FHIT gene replacement therapy in human leukemia using a chimeric adenovirus，Ad5/F35 [J]. Clin Cancer Res,2006,12(11 Pt1):3494-3501.

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　　[9] Wali A, Srinivasan R, Shabnam MS, et al. Loss of fragile histidine triad gene expression in advanced lung cancer is consequent to allelic loss at 3p14 locus and promote rmethylation [J]. Mol Cancer Res,2006,4(2):93-99.