3，4- 二氯异香豆素对胃癌细胞Smad1和PTEN基因的影响

　　作者：刘飞，姜藻，顾晓怡，费正华，苏沐，任雪萍 作者单位：东南大学附属中大医院 肿瘤中心,江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的：探讨蛋白酶体抑制剂3，4- 二氯异香豆素(DCI)对人胃癌细胞株BGC- 823细胞Smad1及PTEN基因的影响。方法：MTT法检测DCI、5-FU单药及联合干预后BGC- 823细胞的生存率，流式细胞术检测细胞凋亡率及周期分布状况，RT- PCR法检测Smad1和PTEN基因表达。结果：75 μmol·L–1 DCI干预24 h后，细胞生存率为(84.0±9.60)%，750 μmol·L–1DCI作用72 h后，细胞生存率仅有(20.3±9.7)%;同时，当DCI浓度从150 μmol·L–1上升至600 μmol·L–1时，细胞凋亡率相应地从15.0%增加至27.8%;DCI可以增强5-FU对胃癌细胞的杀伤作用;DCI浓度依赖性地上调Smad1和PTEN基因表达(P<0.05)，当DCI浓度从150 μmol·L–1上升至600 μmol·L–1时，Smad1和PTEN基因分别从上调19.45%、6.16%升至上调72.85%、48.46%。结论：蛋白酶体抑制剂DCI可能通过干预骨形态发生蛋白(BMP)信号通路减少Smad1降解、增加PTEN表达，产生抗肿瘤效应。

　　【关键词】 胃癌细胞; 3，4- 二氯异香豆素; Smad1; PTEN

　　泛素介导的蛋白酶体降解是调节骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号转导功能的重要机制，蛋白酶体抑制剂可剂量依赖性地逆转Smad泛素调节因子1(smad ubiquitin regulatory factor 1，Smurf1)对Smad1、5的降解作用[1- 4]。由于Smads是BMP信号通路中的关键调节因子,因此改变Smads蛋白水平可能影响BMP信号通路及靶基因如PTEN的状态。本实验探讨蛋白酶体抑制剂3,4-二氯异香豆素(3，4-dichloroisocoumarin,DCI)对胃癌细胞株BGC- 823细胞Smad1及PTEN基因的影响，以及DCI联合5-FU对BGC- 823细胞株增殖的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试剂及仪器 DCI(Santa cruz 公司)，贮存于-4 ℃;5-FU(上海旭东海普药业有限公司产品);MTT及DMSO(Sigma公司);酶标仪(Model- 550，BIO- RAD公司); Annexin- Ⅴ检测试剂盒及周期试剂盒(Becton Dickinson公司);流式细胞仪FACS Calibur(美国BD公司);逆转录试剂盒及PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司);TaKaRa试剂盒;引物由Invitrogen公司合成;PCR扩增仪Eppendorf 5331(Eppendorf公司);紫外分光光度仪JENWAY6405(英国JENWAY公司);凝胶成像分析系统LMS- 26E(UVP公司)。

　　1.1.2 细胞及培养 胃腺癌细胞BGC- 823由作者所在实验室传代培养，在含10%胎牛血清的培养液中呈单层贴壁生长，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，用0.25%胰酶消化后制成细胞悬液备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT法试验 取对数生长期的BGC- 823细胞，接种于96孔板，每孔细胞数为1.5×104个。培养24 h，加入含不同浓度DCI和(或)5-FU的新鲜培养液，每浓度设3个复孔，进行分组。单纯DCI组：加25、50、75、150、300、450、600、750 μmol·L-1的DCI;单纯5-FU组：加12.5、25、50、100、200 mg·L–1的5-FU; 5-FU加DCIa组：加12.5、25、50、100、200 mg·L–1的5-FU，同时每孔联用25 μmol·L–1 的DCI;5-FU加DCIb组：加12.5、25、50、100、200 mg·L–1的5-FU，同时每孔联用50 μmol·L–1的DCI;对照组：予不含DCI或5-FU的培养液。除单纯DCI组孵育24、48、72 h外，其余各组孵育24 h后用MTT法测每孔吸光度(A)值。

　　1.2.2 流式细胞术分析 取对数生长期BGC- 823细胞，以不同浓度DCI处理后，采用流式细胞术定量分析细胞凋亡状况及周期分布。

　　1.2.3 RT-PCR检测 取对数生长期BGC- 823细胞约1×106 ml–1，分别予150、300、450、600 μmol·L–1 DCI干预，37 ℃培养24 h后，用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA。紫外分光光度仪测纯度和浓度，取 3 μl RNA行RT反应，得各自的总cDNA。取cDNA 产物2 μl，分别以Smad1(5′- aaacagggcgatgaagaaga- 3′，5′- ccacacacggcagtaaatga- 3′,216 bp,退火温度59.8 ℃)及PTEN(5′- aggcacaagaggccctagat- 3′，5′- aacttgtcttcccgtcgtgt- 3′,274 bp,退火温度60.2 ℃)两种基因上下游引物各10 pmol作PCR扩增，β-actin(5′- tgacggggtcacccacactgtgcccatcta-3′,5′-ctagaagcatttgcggtggacgatggaggg-3′，661 bp)作为内参照，按照PCR试剂盒程序扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，BIO- RAD凝胶成像分析仪观察摄像，Quantitative One软件分析，每个样本至少重复3遍。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据用x-±s表示，采用SAS 8.0统计学软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MTT试验结果

　　75～750 μmol·L–1的DCI对BGC- 823细胞均有抑制作用，显示出时间、浓度依赖性(P<0.05)，24、48 h 的IC50 分别为511.71、388.78 μmol·L–1，详见图1。DCI可增强5-FU对胃癌细胞的杀伤作用，联合组生存率明显低于单药组(P<0.05)，详见图2。

　　2.2 流式细胞术检测结果

　　不同浓度DIC干预后细胞凋亡率明显增加(P<0.05)，存在浓度依赖性(见图3)。5-FU作用于胃癌细胞后G2/M期细胞明显减少，G2期前出现凋亡峰;DCI处理后,G2/M期细胞增加;联合组胃癌细胞凋亡率明显增加(P<0.05);相对低浓度DCI联合组凋亡率高于高浓度组(P<0.05)。见表1。

　　2.3 RT- PCR检测结果

　　经DCI处理，Smad1和PTEN基因表达上调(P<0.05)且随着浓度增加，相关基因表达上调增加，存在显著性统计学差异(P<0.05),详见表2及图4。

　　3 讨 论

　　BMP有20个亚型，除了BMP- 1属于金属蛋白酶的虾红素家族外，其余的都属于转化生长因子- β超家族成员。BMP信号通路通过Smad途径或细胞分裂素1 5-FU、DCI及两药联用后细胞凋亡率及周期分布 (丝裂原)活化蛋白激酶途径进入核内调节各种基因的转录，其中，PTEN基因是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因[5- 6]。BMP信号通路被认为是一个肿瘤抑制途径，因此该途径的失活被认为是肿瘤发生的原因之一[7]。

　　BMP信号通路的靶基因PTEN具有多种生物学功能：(1)抑制细胞生长;(2)抑制细胞黏附和运动;(3)维持免疫系统的稳定性;(4)降低机体对肿瘤的易感性[8- 9];(5)增强肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性[10]。已有多项研究发现在BMP信号通路和PTEN基因之间存在紧密联系：在乳腺癌株MCF- 7中发现，BMP- 2的表达增加PTEN水平，并存在时间剂量依赖关系;PTEN蛋白的快速增加并不是由于新蛋白的合成增加，而是减少了PTEN和降解路径中UbCH7、UbC9两种蛋白的结合;进一步研究发现，由于减少了泛素降解通路中相关蛋白，BMP- 2高表达使得PTEN蛋白水平提高，从而导致细胞增值减少[11]。

　　泛素介导的蛋白酶体降解是调节BMP信号转导功能的重要机制之一，与BMP信号通路中Smad1、5具有相互作用的Smurf1具有如下功能：(1)Smurf1与Smad1、5作用后，导致Smad蛋白以及与Smad蛋白相互作用的蛋白质的泛素化和降解;(2)Smurf1还可协同Smad6/7引发BMP受体(BMPRs)的降解[1- 4]。蛋白酶体抑制剂可剂量依赖性地逆转Smurf1对Smad1的降解作用，由于Smads是BMP信号通路中的关键调节因子,因此改变Smads蛋白水平势必影响BMP信号通路及其靶基因的状态。

　　本研究证实DCI呈时间、浓度依赖性地抑制BGC- 823细胞生长，促进细胞凋亡(P<0.05)，进一步证实了前期研究结果[12]。深入的研究发现，这种作用可能与DCI上调Smad1和PTEN基因表达有关(P<0.05)，因为，随着DCI浓度从150 μmol·L–1上升至600 μmol·L–1，Smad1和PTEN基因分别从上调19.45%、6.16%升至上调72.85%、48.46%，存在显著的浓度依赖性(P<0.05)。据此推测，在DCI诱导BGC- 823细胞凋亡过程中，蛋白酶体抑制剂DCI可以干预BMP信号通路，逆转Smurf1对Smad1的降解作用，使Smad1表达上调，通过Smad途径进入核内，减少PTEN基因的降解——PTEN表达上调，从而发挥抗肿瘤效应。同时，DCI可以使BGC- 823细胞阻滞在G2/M期，而5-FU对G2/M期细胞具有明显杀伤作用。故DCI可以增强5-FU对胃癌细胞的抑制作用，在基因水平推测，DCI的化疗增效作用可能与PTEN基因上调有关，该结论尚待进一步研究证实。

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