nm 23-H1基因蛋白和核增殖抗原在喉鳞状上皮癌中的表达及其意义

　　作者：朴杰,严龙国,严永锋 作者单位：延边大学医学部，吉林 延吉 133000

　　【摘要】 [目的] 探讨nm 23-H1基因蛋白及核增殖抗原(PCNA)在喉鳞状上皮癌中的表达及其与临床病理特征的关系. [方法] 选择喉鳞状上皮癌标本50例，另选择喉癌旁黏膜标本10例，采用免疫组织化学SP法进行染色，观察nm 23-H1基因蛋白和PCNA的表达情况，分析PCNA和nm 23-H1基因蛋白的表达与喉鳞状上皮癌的病理类型、TNM分级、临床分期及淋巴结转移情况的关系. [结果] nm 23-H1基因蛋白在喉鳞状上皮癌中的表达率为68%，在喉癌旁组织中为90%,两者间比较有显著性差异;nm 23-H1基因蛋白的表达强度与喉鳞状上皮癌的TNM分级、临床分期和淋巴结转移情况呈显著相关.PCNA在喉鳞状上皮癌中的表达率为74%，在喉癌旁组织中为40%，两者间比较有显著性差异;PCNA的表达强度与喉鳞状上皮癌的组织学类型、TNM分级、临床分期和淋巴结转移情况呈显著相关. [结论] nm 23-H1基因蛋白和PCNA的表达强度可作为判断喉鳞状上皮癌生物学特性的主要指标，nm 23-H1基因蛋白低表达和PCNA高表达与喉鳞状上皮癌生物学特性有关.喉鳞状上皮癌组织中nm 23-H1基因蛋白和PCNA的表达呈负相关.

　　【关键词】 癌，鳞状细胞;喉肿瘤;免疫组织化学;增殖细胞抗原

　　Expression and significant of nm 23-H1 and PCNA protein in the laryngeal squemous cell cacinoma

　　PIAO Jie, YAN Long-guo, YAN Yong-feng

　　(Yanbian University Health Science Center, Yanji 133000, Jilin, China)

　　ABSTRACT: OBJECTIVE To study the expression of nm 23-H1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in laryngeal squemous cell cacinoma(LSCC) and its relationship with the characteristis of clinicopathology. METHODS The expression of nm 23 and PCNA was detected by immunohistochemical SP method in 50 cases of LSCC and 10 cases of normal laryngeal mucosa, and the relationship among expression of PCNA and nm 23-H1 gene protein and pathologic type, TNM grade, clinical stage, and metastasis of lymph node. RESULTS The positive rate of nm 23 H1 was 68% and 90% in LSCC and normal larynx mucosa, respectively, and there was a significant difference between two groups. The intensity of positive expression of nm 23 H1 was significantly related with the TNM grade, clinical stage and metastasis of lympho node in LSCC. The positive rate of PCNA was 74% and 40% in LSCC and normal larynx mucosa, respectively，and The intensity of positive expression of PCNA was significantly related with the histopathological type, TNM grade, clinical stage and metastasis of lympho node in LSC. CONCLUSION The intensity of positive expression of nm 23 H1and PCNA can be as the important index for judging the biological characteristics of LSCC. The low expression of nm 23 H1 and high expression of PCNA is related with biological characteristics of LSCC. There is negative correlation between the expression of nm 23 H1 and PCNA protein in LSCC.

　　Key words:carcinoma, squamous cell;laryngeal neoplasms;immunohistochemistry;proliferating cell nuclear antigen

　　喉鳞状上皮癌是常见的喉部恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的2%，且发病率呈逐年上升趋势.本研究选择50例喉鳞状上皮癌标本，观察了癌组织中nm 23-H1基因蛋白和PCNA的表达情况，探讨了PCNA和nm 23-H1基因蛋白的表达与喉鳞状上皮癌的病理类型、TNM分级、临床分期及淋巴结转移的关系.

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 选择2000年1月—2005年12月在延边大学附属医院手术切除的50例喉鳞状上皮癌病理标本，全部患者中男性为45例，女性为5例;平均年龄为61岁.全部标本均经100 g/L甲醛固定，常规石腊包埋，行5 μm厚连续切片.鼠抗人nm-23 H1单克隆抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体和通用型SP kit盒均为北京中山公司产品，工作液浓度均为1∶80;试剂盒：试剂A为封闭用正常羊血清工作液;试剂B为生物素化二抗工作液羊抗鼠IgG;试剂C为辣根酶标记链霉素卵白素工作液S-A/HRP.仪器：石蜡切片机为LEICA RAi 2135型;OLYMPUS光学显微镜为日本OLYMPUS公司产品;真彩色病理图像分析系统为CMIAS系列，为北京航空航天大学产品;CD-t型快速生物医学微波炉为上海创大科技有限公司产品.

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学S-P法进行染色.具体步骤：石蜡切片，常规脱蜡，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min(如需采用抗原修复，则在此步骤后进行)，30 mL/L过氧化氢去离子水(五色液体)孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性;滴加试剂A(蓝色液体)，室温孵育10～15 min，滴加适当比例稀释的一抗，37 ℃孵育2，3 h或4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min;滴加试剂B(黄色液体)，37 ℃孵育10～15 min，PBS冲洗3次，每次3 min;滴加试剂C(橙色液体)，37 ℃孵育10～15 min，PBS冲洗3次，每次3 min;DAB或AEC显色剂显色，自来水冲洗，酒精脱水，透明，封片，如果需要可行复染.

　　1.2.2 结果判断 nm 23-H1基因蛋白阳性表现为在癌细胞的胞浆及胞膜上着色，以胞浆为主，呈棕黄色颗粒;PCNA阳性表现为在细胞核内着色，呈棕黄色颗粒.阳性细胞数少于15%时判定为阴性，多于15%为阳性.

　　1.2.3 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件对数据进行确切概率法处理.

　　2 结果

　　2.1 组织学分类 按WHO喉癌的病理分类标准进行组织学分类，本组50例喉鳞状上皮癌标本中高分化鳞状上皮癌(图1 A)为31例，中分化鳞状上皮癌(图1 B)为15例，低分化鳞状上皮癌(图1 C)为4例.

　　A:高分化鳞状上皮癌;B：中分化鳞状上皮癌;C：低分化鳞状上皮癌

　　图1 喉鳞状上皮癌HE染色所见 ×1002.2 临床分期 TNM分期结果示，50例喉鳞状上皮癌患者中T1级者为11例,T2级者为23例,T3级者为12例,T4级者为4例;临床分期中Ⅰ-Ⅱ期者为30例，Ⅲ-Ⅳ期者为20例;有颈部淋巴结转移者为8例，无淋巴结转移者为42例.

　　2.3 免疫组织化学染色 nm 23-H1基因蛋白表达主要位于细胞浆，呈棕黄色颗粒，偶可见细胞核着色.PCNA阳性染色位于细胞核内，阳性细胞弥散分布，近基底层阳性细胞较多，染色较重，癌旁黏膜上皮也呈阳性表达，由基底层向上阳性细胞数量逐渐减少.

　　2.3.1 癌组织中nm 23-H1基因蛋白的表达及其与临床病理特征的关系 nm 23-H1基因蛋白在喉鳞状上皮癌组织中的表达率为68%，在癌旁组织中为90%,两者间比较有显著性差异(P<0.05);nm 23-H1基因蛋白表达强度在喉鳞状上皮癌的病理分化程度间无显著性差异(P>0.05)，但与临床分期、TMN分期和淋巴结转移情况呈显著相关(P<0.05);见表1.高、中及低分化鳞状上皮癌组织中nm 23-H1基因蛋白表达情况见图2.

　　2.3.2 癌组织中PCNA的表达及其与临床病理学特征的关系 PCNA在喉鳞状上皮癌组织中的表达率为74%，在癌旁组织中为40%，两者间比较有显著性差异(P<0.05);PCNA表达强度与喉鳞状上皮癌的病理分化程度、TNM分期、临床分期及淋巴结转移情况均呈显著相关，(P<0.05);见表1.高、中及低分化鳞状上皮癌组织中PCNA的表达情况见图3.表1 喉鳞状上皮癌组织中nm 23-H1基因蛋白及PCNA的表达及其与临床病理学特征的关系

　　2.3.3 nm 23-H1基因蛋白与PCNA在喉癌组织中表达的相关性 nm 23-H1基因蛋白低表达与PCNA高表达与喉鳞状上皮癌的生物学特性有关，两者呈负相关.

　　3 讨论

　　目前认为，喉鳞状上皮癌的发病与吸烟、饮酒、空气污染、职业因素及病毒感染等多种因素有关.近年来研究结果表明，几乎所有的肿瘤都存在1种以上的与细胞周期调控相关的基因发生突变，细胞周期调控异常与肿瘤的发生密切相关.侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特性，是影响预后的重要因素，探索肿瘤侵袭转移机制，寻找有价值的预测预后及指导临床治疗的生物学指标已成为肿瘤研究的新热点[1～4].nm 23-H1基因蛋白定位于人类染色体17 q 22,产物为由152个氨基酸组成的17 ku的细胞核及胞浆蛋白，它的氨基酸序列与二磷酸核苷激酶(nucleotidediphosphate kinase, NDPK)有高度的同源性[5～7].目前认为，nm 23-H1基因蛋白可能是具有NDPK功能的基因，nm 23-H1基因蛋白可能通过与NDPK蛋白一致或相似的途径在调节细胞信号传递及细胞分化的过程中发挥作用.研究发现，nm 23-H1 mRNA表达水平与肿瘤的转移潜能及淋巴结转移状态呈负相关.Sikorska等[8]认为，喉鳞状上皮癌淋巴结转移患者nm 23-H1基因蛋白的表达明显少于未转移患者，喉鳞状上皮癌组织中nm 23-H1基因蛋白低表达者的生存时间明显短于高表达者.本组50例喉鳞状上皮癌标本中nm 23-H1基因蛋白表达率与癌旁组织间比较有显著性差异，提示癌细胞的增殖与nm 23-H1基因蛋白量密切相关.研究结果表明，nm 23-H1基因蛋白的阳性表达与喉鳞状上皮癌的分化程度无明显相关性，与TNM分级及临床分期有显著相关性，即TNM分级越高和临床分期越高，nm 23-H1基因蛋白的表达率越低.本实验结果表明，有淋巴结转移患者的标本中nm 23-H1基因蛋白的表达率明显低于无转移患者，与文献[8]报道相符.PCNA是分子质量为36 ku的核蛋白，是DNA多聚酶的辅助蛋白，是细胞DNA合成期不可缺少的因子，亦是细胞周期调节蛋白，表达量在Gl早期开始上升，S期达到最高，G2及M期持续下降，G0期维持在低水平[9].组织学分级从高分化到低分化的鳞状上皮癌组织中PCNA的阳性率递增，但低分化伴有大量淋巴细胞及浆细胞浸润者癌组织中PCNA的阳性率较低.研究结果表明，PCNA蛋白在TNM分期Ⅲ-Ⅳ期、低分化癌、复发、有颈淋巴结及远处转移患者中的表达水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期、高中分化、初发及无转移患者.PCNA蛋白的表达与患者预后明显相关，对Cox比例风险模型进行分析发现,PCNA表达是患者预后不良的主要指标.本实验结果表明，PCNA蛋白在喉鳞状上皮癌组织中有较高的表达，而在癌旁组织中则较低的表达，两者间比较有显著性差异;PCNA蛋白表达率与喉鳞状上皮癌的分化程度、TMN分级、临床分期、淋巴结转移情况有显著相关性，即TNM分级越高，临床分期越高，其表达率越高.本实验结果亦表明，在喉鳞状上皮癌组织中nm 23-H1基因蛋白表达与PCNA表达量之间呈负相关，其机制尚待进一步探讨.综上所述,nm 23-H1基因蛋白和PCNA的表达强度可作为判断喉鳞状上皮癌生物学特性的主要指标，nm 23-H1基因蛋白低表达和PCNA高表达与喉鳞状上皮癌生物学特性有关.

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