直肠癌术后放化疗联合DC-CIK回顾性疗效分析

　　作者：魏植强， 杨建伟， 陈路川， 郑秋红， 应敏刚 作者单位：福建医科大学教学医院,福建省肿瘤医院，福州 350014

　　【摘要】 目的 探讨放化疗联合树突细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)疗法的临床疗效。 方法 回顾性分析41例直肠癌根治术后行放化疗联合DC-CIK细胞疗法患者的临床资料，以性别、年龄、肿瘤分化程度、AJCC(1997)中的TNM临床分期、手术方式、术后辅助化疗的方案、是否实施全直肠系膜切除术、是否接受术后辅助放疗为指标，采用1∶2配对方法在同期接受直肠癌根治术但未接受DC-CIK细胞疗法的患者中选择82例作为对照，采用Kaplan-Meier法计算生存率，采用单因素和多因素Cox回归法分析直肠癌的预后影响因素，对比两组的3年生存率(OS)和3年无病生存率(DFS)。 结果 单因素分析表明，肿瘤分化程度、TNM分期、是否实施全直肠系膜切除术、是否实施DC-CIK治疗为直肠癌预后的影响因素。术后辅助放疗是Ⅱ、Ⅲ期直肠癌的预后影响因素。多因素回归分析表明，TNM分期、是否实施全直肠系膜切除术、是否接受术后辅助放疗、是否实施DC-CIK治疗是Ⅱ、Ⅲ期直肠癌的独立预后因素。DC-CIK治疗组3年生存率(OS)(73.2% vs 56.1%)，差别具有统计学意义(P<0.05)。DC-CIK治疗组3年无病生存率(DFS)(58.5% vs 41.5%)，差别具有统计学意义(P<0.05)。 结论 TNM分期、是否实施全直肠系膜切除术、是否接受术后辅助放疗、是否实施DC-CIK治疗是Ⅱ、Ⅲ期直肠癌的独立预后因素。直肠癌根治术后放化疗联合DC-CIK细胞疗法有可能改善患者的远期生存率和无病生存率。

　　【关键词】 直肠肿瘤; 化学疗法，辅助; 树突细胞; 细胞因子类; 存活率

　　直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，而大部分直肠癌是低位直肠癌，复发、转移或死亡率近50%[1]，以手术为主的综合治疗是提高直肠癌治疗效果的关键。目前传统的手术治疗、放疗、化疗已有改进和发展，直肠癌的总体无病生存率和总生存率有明显改善。为进一步减低复发率及提高远期生存率，以树突细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)疗法为基础的肿瘤免疫治疗成为目前研究的热点之一。笔者医院自2005年6月至今在直肠癌根治术后放化疗的基础上加以DC-CIK疗法，现总结报道如下。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 收集2005年6月-2006年8月住院患者123例，均经病理学、组织学、细胞学等检查确诊为直肠癌，并行直肠癌根治术，术后病理证实为R0切除，均为AJCC(1997)TNM分期的Ⅰ~Ⅲ期患者。Ⅰ期患者术后不行放化疗，Ⅱ~Ⅲ期患者行术后辅助放化疗。DC-CIK治疗组41例，男性18例，女性23例，中位年龄54岁(28~77岁);Ⅰ期8例，ⅡA期7例，ⅡB期3例，Ⅲ期23例，术中实施全直肠系膜切除技术31例，术后辅助化疗采用氟尿嘧啶+亚叶酸钙+奥沙利铂联合用药(FOLFOX)方案26例，采用希罗达+奥沙利铂联合用药(XELOX)方案7例，接受术后辅助放疗的18例。对照组82例，男性41例，女性41例，年龄中位数55.5岁(20~77岁);Ⅰ期17例，ⅡA期16例，ⅡB期6例，Ⅲ期43例，术中实施全直肠系膜切除技术58例，术后辅助化疗采用FOLFOX方案47例，采用XELOX方案18例，接受术后辅助放疗的30例。两组患者卡氏评分均≥80分，肝、肾功能正常，外周血WBC≥4.0×109 L-1，PLT≥100×109 L-1，Hb≥80 g/L，无严重的内科疾病。

　　1.2 方法 参照文献[2-3]。分离患者新鲜抗凝外周全血50 mL，经淋巴分离液梯度离心，取界面层单个核细胞，用RPMI 1640培养液悬浮细胞，离心洗涤细胞3次后，收集非贴壁细胞，调整细胞密度约为1×106 mL-1，加入γ-干扰素1 000 U/mL，24 h后加入白细胞介素(rhIL)-2 300 U/mL，抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)70 ng/mL，IL-1 10 U/mL，每3 d换液1次，同时补加rhIL-2 100 U/mL。在上述获得的贴壁细胞中加入含粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)1 000 U/mL，rhIL-4 1 000 U/mL的AIM-V培养基，每3 d换液1次。第3天将肿瘤抗原加入DC培养液内，第5天加入TNF-α 1 000 U/mL，第7天将部分负载后的DC按1∶5的比例加入细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)培养液中，共培养5～7 d。培养10 d后制成细胞悬液用输血器回输，隔日回输1次，将DC-CIK两种细胞体外混合后全身输注。剂量：DC-CIK回输每瓶100 mL，细胞数≥108 mL-1，连续8次为1疗程。治疗组最少进行1疗程DC-CIK治疗，最多进行6疗程，平均进行4疗程。DC-CIK给药时间一般在术后或化疗结束后15 d开始。

　　1.3 化疗方案和放疗方案 所有Ⅱ~Ⅲ期患者进行术后辅助化疗，采用FOLFOX或XELOX方案化疗6~8周期不等。术后对Ⅱ~Ⅲ期患者部分有辅助放疗，方案为术后4~6周放疗，照射量2 Gy/f×第1~5天/周×5周，总照射量为50 Gy。

　　1.4 临床观察 治疗期间详细观察患者症状、体征变化，于治疗前后分别检测患者外周血白细胞、肝功能及肾功能。密切观察是否出现各种不良反应，并记录其发生时间、表现及转归。每隔3月复查胸部X线或CT腹部B超、腹部CT，了解有无复发转移。

　　1.5 疗效评价 以复发时间和生存期(自手术时间-2009年8月1日)为观察指标，比较治疗组和对照组的差异。

　　1.6 统计学处理 采用SPSS 15.0软件包进行分析。生存率计算用Kaplan-Meier法，显著性比较采用Logrank test检验，率检验采用χ2检验，将单因素分析有意义的因素引入Cox比例风险模型进行多因素分析，以P<0.05为差别具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 临床资料分析 采用同期非随机对照研究，观察治疗组与对照组的临床疗效，以复发时间和生存期为观察指标。从性别、年龄、病理分期、AJCC(1997)中的临床分期、手术方式、术后辅助化疗的方案、是否接受全直肠系膜切除术、是否接受术后辅助放疗为指标等方面比较两组的可比性，结果示2组资料差别无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　2.2 单因素分析 单因素分析结果显示：肿瘤分化程度(χ2=13.381,P=0.004)、TNM分期(χ2=29.903,P=0.000)、是否实施全直肠系膜切除术(χ2=10.471,P=0.001)、是否实施DC-CIK治疗(χ2=3.936,P=0.008)为直肠癌预后的影响因素;术后辅助放疗是Ⅱ、Ⅲ期直肠癌的预后影响因素(χ2=7.076,P=0.008);性别、年龄、手术方式及化疗方案(FOLFOX和 XELOX的不同)对直肠癌预后无影响(P>0.05，表2)。

　　2.3 多因素分析 将直肠癌患者临床病理因素单因素分析中对预后有影响的因素进入多因素分析。表1 治疗组与对照组的临床资料直肠癌术后放化疗联合DC-CIK回顾性疗效分析由于目前直肠癌通常采用的放化疗原则是：Ⅰ期直肠癌患者术后不常规行放化疗。多因素分析只针对Ⅱ、Ⅲ期直肠癌患者。结果显示：实施全直肠系膜切除术(P=0.047)、TNM分期(P=0.001)、术后辅助放疗(P=0.008)、术后DC-CIK治疗(P=0.008)为Ⅱ、Ⅲ期直肠癌预后的独立影响因素(表3)。

　　2.4 生存分析 全部病例随访至2009年8月，随访时间11～47月，无失访，随访率100%。DC-CIK联合放化疗治疗组的41例与同期单纯接受放化疗的对照组82例比较，治疗组1，2，3年生存率分别为100%，92.7%，73.2%;对照组1，2，3年生存率分别为98.8%，82.9%和56.1%。治疗组和对照组中位生存期(mOS)为42月(95%CI，40~45)、37月(95%CI，34~40)。Kaplan-Meier生存曲线和Logrank test检验结果表明治疗组生存期明显长于对照组(P<0.05，图1)。表2 直肠癌患者临床病理因素的单因素分析

　　2.5 无病生存率(DFS)分析 全部病例随访至2009年8月，随访时间6～47月，无失访，随访率100%。DC-CIK联合放化疗治疗组的41例与同期单纯接受放化疗的对照组82例比较，DC-CIK治疗组1，2，3年DFS分别为92.7%，65.9%，58.5%;对照组1，2，3年DFS分别为68.3%，43.9%和41.5%。治疗组和对照组组中位无病生存时间(mDFS)分别为34月(95%CI，30~39)、26月(95%CI，22~30)。Kaplan-Meier生存曲线和Logrank test检验结果表明治疗组无病生存率明显高于对照组(P<0.05，图2)。表3 直肠癌患者临床病理因素的多因素分析

　　3 讨 论

　　直肠癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。DC-CIK细胞具有增殖快、杀伤活性强等优点，在直肠癌的治疗中具有广阔应用前景。细胞因子诱导的杀伤细胞CIK细胞(cytokine-induced killer cells)是一种新型免疫活性细胞，兼有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的非主要组织相关性复合物限制性杀瘤的特点，杀伤活性可达84.7%。树突细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，可有效激发T细胞应答，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。DC与CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，前者识别病原，激活获得性免疫系统，后者通过发挥自身细胞毒性和分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞，二者联合确保了一个高效和谐的免疫反应的完成。DC-CIK细胞抗肿瘤治疗的特点：(1)DC刺激CIK细胞后，细胞毒活性显著增强。(2)DC与CIK细胞共培养时，DC成熟表面标志CD86、CD80、CD40、HLA-DR的表达增加，细胞上清IL-12、IFN-r分泌量明显增加。(3)DC细胞激活CIK细胞增殖，从而得到大量高效的免疫细胞。Shebzukhov等报道，直肠癌术后辅助化疗常使细胞免疫抑制加重，出现CD3+下降、CD8+升高、CD3+/CD8+倒置、NK细胞活性下降[4]。索冰等应用DC与CIK细胞共同培养研究对LOVO结肠癌细胞株的杀伤及诱导凋亡作用[5]，结果显示DC可以显著提高CIK的增殖活性，在各个效靶比(10∶1，20∶1，40∶1)对大肠癌细胞LOVO杀伤率均高于单独的CIK细胞组，且随着效靶比的增高，效应细胞对靶细胞的杀伤率(E∶T)也呈不同程度的增高。因此，DC-CIK可能通过改善机体免疫功能，加强对肿瘤细胞的杀伤及诱导凋亡作用来降低直肠癌术后的复发和转移。

　　Benoist等对32 000例直肠癌进行分析发现，其中直肠癌3年和5年生存率分别为65%和45.1%[6]。目前大宗病例报告，直肠癌术后3年生存率在60%左右，局部复发和远处转移是治疗失败的主要原因。直肠癌局部/区域复发率与直肠癌的分期密切相关。本文除了对直肠癌预后进行单因素分析外，还采用了UICC推荐的Cox模型来进行直肠癌预后的多因素分析。单因素分析表明，肿瘤分化程度、TNM分期、是否实施全直肠系膜切除术、是否实施DC-CIK治疗为直肠癌预后的影响因素。术后辅助放疗是Ⅱ、Ⅲ期直肠癌的预后影响因素。多因素回归分析表明，TNM分期、是否实施全直肠系膜切除术、是否接受术后辅助放疗、是否实施DC-CIK治疗是Ⅱ、Ⅲ期直肠癌的独立预后因素。生存分析表明DC-CIK治疗组的3年OS与对照组差别有统计学意义(P<0.05)，DC-CIK治疗组3年DFS与对照组差别有统计学意义(P<0.05)。提示直肠癌根治术后放化疗联合DC-CIK细胞疗法有可能降低复发率，并很有可能对提高直肠癌患者的远期生存率有帮助。但由于本次入组患者从2005年开始进行DC-CIK细胞治疗，目前尚不能统计这批患者的5年生存率，有待今后对这批患者继续随访，以证实直肠癌根治术后放化疗联合DC-CIK细胞疗法对直肠癌远期生存的影响。本组研究还缺乏大样本临床病例的支持，需争取更大样本群体的积累。

　　【参考文献】

　　[1] 李 明,顾 晋.中国结直肠癌20年来发病模式的变化趋势[J]. 中华胃肠外科杂志, 2006,7(3)：214-217.

　　[2] 郑秋红,郑天荣,谢云青,等. 树突状细胞对自体CIK细胞体外杀伤肺腺癌细胞影响的研究[J]. 肿瘤防治杂志, 2005,12(16):1237-1241.

　　[3] 郑秋红,郑天荣,卢 林,等. 人外周血树突细胞的分离与提纯[J]. 福建医科大学学报, 2000,34(2):115-120.

　　[4] Shebzukhov Y V,Koroleva E P,Khlgatian S V,et al.Human immune response to thymidylate synthase in colon cancer patients after 5-Fu chemotherapy[J]. Immunol Lett, 2005,100(1)：88-93.

　　[5] 索 冰,王志华,梅 芬. 树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对大肠癌细胞株LOVO体外杀伤作用的研究[J]. 实用肿瘤学杂志, 2009,23(3)：219-221.

　　[6] Benoist S,Nordlinger B. Neoadjuvant treatment before resection of liver metastases[J]. Eur J Surg Oncol, 2007,33(Suppl 2):35-41.