API2靶向抑制PI3K/Akt信号通路干预胃癌细胞生长的研究
发表时间：2010-10-29 浏览次数：299次
作者：黄昌明，吴日平 作者单位：福建省教育厅B类科技项目(JS07009) 福建医科大学 附属协和医院肿瘤科，福州 350001
【摘要】 目的 研究蛋白激酶B抑制剂2(API2)靶向抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点，从而对胃癌细胞生长的影响。 方法 使用API2处理人胃癌细胞株SGC7901。MTT法检测0,2,4,6,8 μmol/L API2作用不同时间对细胞增殖的影响;荧光染料AO/EB染色观察不同浓度API2作用24 h后细胞凋亡情况;流式细胞仪检测细胞周期变化;Western blot法检测pAKT蛋白以及下游蛋白NFκB表达情况。 结果 API2可抑制SGC7901细胞的增殖，并呈浓度和时间依赖性;不同浓度API2作用24 h后，对细胞的部分周期有明显的影响，也可直接导致肿瘤细胞凋亡、坏死，并且pAKT蛋白及下游蛋白NFκB表达均减少。 结论 API2有效地抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点，影响SGC7901细胞的周期，减少NFκB的表达，具有增殖抑制及诱导凋亡作用。
【关键词】 胃肿瘤;蛋白酶抑制药;1磷脂酰肌醇3激酶;蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶;NFκB;信号传导;细胞凋亡;肿瘤细胞,培养的
Effects of Selective Inhibition by API2 on the Growth of Gastric Cancer Cells
HUANG Changming, WU Riping
Department of Oncology, The Affiliated Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001
ABSTRACT: Objective To study the effect of the inhibition of Akt by API2 in PI3K/Akt signaling pathway on the growth of gastric cancer cells. Methods SGC7901 cells were treated with API2. The effect of API2 (0，2，4，6，8 μmol/L) on their proliferation was observed with MTT assay. Cell apoptosis after treated with API2 for 24 h was observed by AO/EB double staining for fluorescence microscopy. Cell cycle was analyzed by flow cytometry (FCM). The expression of pAKT and NFκB was detected by Western blot. Results API2 (0，2，4，6，8 μmol/L) significantly inhibited the proliferation of SGC7901 cells in doseand timedependent manner. When treated with different densities of API2 for 24 h, parts of the cell cycle of SGC7901 cells were obviously blocked. Apoptosis and necrosis of the tumor cells were increased while pAKT and NFκB expression was decreased. Conclusion API2 can inhibit proliferation and induce apoptosis of SGC7901 cells by effectively inhibiting Akt in PI3K/Akt signaling pathway, affecting cell cycle distributions of the cells, and greatly reducing the expression of NFκB.
KEY WORDS: stomach neoplasms; protease inhibitors; 1phosphatidylinositol 3kinase; proteinserinethreonine kinases; NFkappa B; signal transduction; apoptosis; tumor cells, cultured
PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。核因子κB(nuclear factorkappa B，NFκB)为该信号通路下游的一个效应分子，调节细胞基因转录的关键因子，参与多种相关基因的转录调控，其活性的失控与部分肿瘤密切相关，在肿瘤的发展过程中起重要作用[12]。蛋白激酶B抑制剂2(Akt/protein kinase B signaling inhibitor2, API2)是目前明确的Akt通路小分子抑制剂，能有效地选择性抑制肿瘤细胞中过度表达的Akt，从而抑制细胞生长及促进细胞调亡[3]。本研究使用API2抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点，了解Akt与NFκB在胃癌细胞中表达的关系，及对胃癌细胞生长的影响，旨在寻找胃癌治疗的新靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
人胃癌细胞株SGC7901(上海细胞生物研究所)，胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI1640(美国GIBCO公司)，API2(德国MerckCalbiochem公司)，四甲基偶氮唑蓝[3(4、5dimethylthiazol2YL)2，5diphenyl tetrazolium bromide，MTT]与二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Amresco公司)，兔抗人pAKT1/2/3(Ser473)多克隆抗体、鼠抗人NFκB(p65)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，Western blot试剂盒(美国KPL公司)，GAPDH抗体(上海碧云天公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
SGC7901细胞接种含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，按常规胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。使用不同浓度API2处理人胃癌细胞株SGC7901，以未使用API2处理的SGC7901细胞为对照。
1.2.2 增殖抑制实验
SGC7901细胞以每孔5×103接种于96孔培养板中。API2用DMSO溶解，并调整DMSO终浓度为0.06%。用0,2,4,6,8 μmol/L API2分别处理细胞24,48,72,96 h后，加入MTT作用5 h。离心，弃上清液，加入DMSO振荡溶解后，用酶联免疫检测仪于490 nm波长读取吸光度值，计算增殖抑制率。以上实验重复3次。
增殖抑制率=[(对照组吸光度值实验组吸光度值)/对照组吸光度值]×100%
1.2.3 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色(AO/EB)测定细胞凋亡
细胞以每孔5×105接种在6孔培养板中，用0,4 μmol/L API2分别作用24 h，胰酶消化，离心收集细胞，PBS悬浮细胞2次，取100 μL PBS稀释的细胞悬液，加2 μL的AO/EB染色液，各含100 μg/mL，30 s后观察照相。随机计取5个视野共100个细胞中凋亡细胞百分数。实验重复3次。
凋亡率=总凋亡细胞数/细胞总数×100%
1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期的影响
对数生长期细胞用0,2,4,6,8 μmol/L API2分别作用24 h，用胰酶消化后，收集2×106细胞，预冷PBS洗涤1次，加入70%乙醇4 ℃固定过夜。离心弃乙醇，PBS洗涤2次后加入RNA酶(1 mg/mL)240 μL，37 ℃水浴30 min后，加入PI综合染液(PI浓度为124 μg/mL，Triton X100浓度为0.124%)1 mL，4 ℃避光染色30 min，流式细胞仪进行检测。实验重复3次。
1.2.5 Western blot检测pAKT(Ser473)及NFκB(p65)蛋白表达
收集0,4,8 μmol/L API2分别作用24 h的细胞各2×106，加入RIPA裂解液，4 ℃离心，12 000 r/min，10 min，提取上清并用酶联免疫检测仪测定蛋白浓度。SDSPAGE电泳分离蛋白(每泳道50 μg)后，电转移至NC膜，封闭后分别加入一抗pAKT(1∶500)或NFκB(1∶200)，4 ℃过夜，孵育2 h，TBST20(0.05%)漂洗后二抗(HRP标记的Goat antiMS IgG或Goat antiRabbit IgG)孵育2 h，漂洗后用ECL化学发光试剂盒进行检测。实验重复3次。结果进行灰度扫描后，Quantity One分析软件测定平均光密度，并以GAPDH为内对照，计算pAKT(Ser473)、NFκB(p65)的相对表达量。
1.3 统计学处理
数据均采用中位数±四分位间距[M±(QR)]表示，用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，对照组与各实验组之间分别行Mannwhitney U检验，两变量间相关性采用Spearman相关分析。
2 结 果
2.1 API2对SGC7901细胞增殖的影响
2～8 μmol/L API2可以抑制SGC7901细胞增殖，并呈明显浓度和时间依赖性(图1)。
22.2 API2对SGC7901细胞凋亡的影响
不同浓度API2作用24 h后，荧光显微镜下观察实验组中可见较多凋亡及坏死细胞，而对照组中大部分为活细胞，其胞膜完整，染色质分布均匀，呈均匀弥散绿色荧光(图2)。凋亡率实验组为13.2%，对照组为6.8%。
2.3 API2对SGC7901细胞周期的影响
不同浓度API2作用24 h后，与对照组相比，在G1期，2,4 μmol/L组与对照组的差别均有统计学意义(P<0.05);在G2期，各实验组与对照组的差别均有统计学意义(P<0.05)，在S期，各实验组与对照组的差别均无统计学意义(P>0.05)(表1)。表 1 不同浓度API2作用24 h对SGC7901细胞周期的影响(略)
2.4 API2对SGC7901细胞pAKT(Ser473)、NFκB(p65)蛋白表达的影响
与对照组相比较，4、8 μmol/L API2可使pAKT(Ser473)、NFκB(p65)蛋白表达水平下降，并呈浓度依赖性，不同浓度实验组之间有差别，相关分析表明pAKT(Ser473)表达与NFκB(p65)表达呈显著正相关(r=0.939，P=0.000)(表2，图3)。表 2 不同浓度API2作用24 h对SGC7901细胞AKT和NFκB表达量的影响(略)
3 讨 论
在我国，胃癌是发病最高的癌症之一，对于胃癌的治疗方案主要仍为传统的手术、化疗，且治疗效果和预后不容乐观。国内外学者一直致力于寻找胃癌治疗的新方向。PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要转导通路之一，在人类众多肿瘤谱中表达失调，如卵巢癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤等，其主要是PIK3CA基因编码的PI3K扩增和/或其他多种因素导致的Akt的过度活化，或者是该通路某些调控成分如PTEN的突变所导致的功能缺失[46]。大量研究进一步证实，Akt作为一种潜在的人类癌基因，在许多肿瘤发生中都有磷酸化Akt/PKB基因扩增，最早在胃癌中检测到，pAkt呈持续高度活化，且Akt的异常表达与这些肿瘤的发生、发展以及对放化疗产生的耐受密切相关[7]。目前，以PI3K/Akt信号通路中组成性活化的关键分子为靶点的肿瘤治疗研究正在深入[8]。API2是目前已明确的Akt通路小分子抑制剂，能够有效地抑制Akt，同时不抑制PI3K激酶、PDK1、Akt上游活化物、PKC、PKA、ERK1/2、血清或糖皮质激素诱导的激酶、p38和STAT3等，以及JNK信号通路，具有高度的选择抑制作用[3]。本研究显示，API2作用于SGC7901细胞后，细胞增殖明显受抑制，并呈浓度和时间依赖性，证实了Akt活化与细胞的增殖相关，当API2作用Akt位点后，Akt活化减少，胃癌细胞的增殖受到明显的抑制。
PI3K激活的Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NFκB、Forkhead、mTOR、Par4、P21等，从而介导胰岛素、多种生长因子等诱发的细胞生长，经多种途径促进细胞存活[9]。NFκB作为下游众多效应分子之一，在肿瘤细胞中的典型功能是抗凋亡。NFκB的活性依赖于其抑制蛋白κB激酶(inhibition κB kinase, IKK)复合体的磷酸化和抑制蛋白κB (inhibition κB, IκB)的失调。
Vandermoere等研究证明，Akt能够直接或间接调节IKK的活性，导致NFκB的核转位、活化、和NFκB依赖的促进存活基因的转录[10]。另外，Akt同时还能使NFκB的抑制酶IκB磷酸化，使NFκB进入核内，调节抗凋亡基因的转录[11]。本研究表明，不同浓度API2作用后的实验组与对照组细胞相比，G1期减少G2期增加，而在S期各实验组与对照组均无差别;AO/EB染色实验组可见明显的凋亡及坏死细胞，细胞凋亡率增高;Western blot 检测AKT活化蛋白及其下游活化的NFκB蛋白的表达均受到抑制，并且随API2浓度的增加，两者蛋白表达的减少呈显著正相关。由此可推测，PI3K/Akt信号通路与肿瘤发生发展关系密切，部分可能通过影响细胞周期，将生长的细胞阻滞于周期的某个阶段，部分可能是通过影响下游效应分子NFκB的活化，从而导致肿瘤相关基因转录的启动，这些均能促进肿瘤细胞的增殖，同时抑制细胞的凋亡。
本研究通过选择性抑制PI3K/Akt信号通路中的Akt位点，证实了靶向作用该通路中的关键分子，可干预SGC7901细胞的生长，可能与影响细胞周期，或是干扰下游效应分子的活化，减少肿瘤相关基因的转录有关，但其具体机制仍需进一步深入研究。
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