CD158a表达调节胃癌患者CTL细胞功能的体外研究

　　作者：刘振华, 陈晓耕， 林孟波， 黄 毅 作者单位：福建省立医院，福州 350001 1.肿瘤内科;2.肿瘤外科;3.检验科

　　【摘要】目的 研究CD158a表达对胃癌CTL细胞体外功能的影响。 方法 利用免疫磁珠法分选培养表达与不表达CD158a的两型细胞，MTT法测定其体外杀伤胃癌MNK45细胞的活性，Elispot试验检测其分泌细胞因子的变化，RTPCR方法检测其mRNA的表达差异及CD158a受体激发后(Trigerring)的细胞毒T细胞凋亡情况。 结果 CD158a+ CTL几乎不杀伤人胃癌MNK45细胞，但阻断相应CD158a分子或靶细胞MHC1分子后，杀伤活性得到一定程度恢复。CD158a- CTL以分泌γIFN为主，参与Th1反应，而CD158a+ CTL主要分泌IL4，可能介导Th2反应。3例胃癌患者的CD158a+ CTL细胞均可扩增出300 bp的P58.2 cDNA特征性条带。CD158a分子激发后，CD158a+ CTL凋亡细胞具有显著的形态学特征，DNA电泳有典型的“ladder”梯型条带。 结论 CD158a表达抑制胃癌CTL体外杀瘤活性，影响其细胞因子的分泌，并在激发后诱导CTL细胞凋亡。

　　【关键词】 胃肿瘤 T淋巴细胞 细胞毒性 杀伤细胞 天然 受休 细胞表面

　　近年来，杀伤细胞抑制受体(killer inhibition receptor, KIR)的发现丰富了学者对肿瘤免疫调节的认识。KIR主要表达于人自然杀伤(NK)细胞和某些T淋巴细胞，其中的CD158a分子属于P58.1超家族，相对应人白细胞抗原(HLA)配基为HLACW 2、4、5、6血清型。通过与主要组织相容性复合物抗原Ⅰ类分子(MHC Ⅰ)结合，传递负性调控信号，在机体抗肿瘤免疫及移植排斥中发挥重要调节作用。Gati等研究表明，来源于肾癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒性T细胞(CTL)表面KIR分子可下调CTL杀瘤效能，认为KIR表达是CD8+ CTL免疫无能的主要机制，揭示CD158a分子有助于免疫逃逸[1]。本研究旨在揭示CD158a表达对胃癌CTL细胞体外功能的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 胃癌患者T细胞表达CD158a测定 参照文献[2]的方法，分离3例患者T细胞及诱导CTL细胞，采用直接免疫荧光标记技术，分别标记抗体FITCDX27(antiCD158a，IgG1，美国Immunotech公司)，设同型、同标记鼠抗人单抗作空白对照。检测3例患者的分离新鲜T细胞及其CTL细胞表达CD158a的情况。

　　1.2 CD158a+ CTL与CD158a- CTL的分选培养 利用有限稀释克隆技术，当阳性孔克隆细胞生长到一定数量级(每孔105时，利用荧光标记单抗结合流式细胞仪检测其表型，标记后作相应培养、扩增，AIMV培养基含rIL2 800 IU/mL(北京瑞得一合通公司)。每3～5 d换液1次，每周添加1次抗原及维持量的rIL2 (400 IU/mL)以维持CTL细胞活性。免疫磁珠法分选两型细胞，具体操作参见说明书(美国Stem cells公司)。

　　1.3 CD158a+ CTL与CD158a-CTL细胞的体外杀瘤活性 人胃癌MNK45细胞由苏州大学医学院张学光教授惠赠。体外杀瘤活性检测取效∶靶比(10∶1)，MTT法测定[3]，λ=490 nm，计算公式为：

　　杀伤活性(%)=(D实验孔-D阴性对照)/D无杀伤对照×100%

　　每组设三复孔，实验中，只有靶细胞孔为无杀伤对照，效应细胞孔为阴性对照孔。杀伤阻断试验选用单抗为抗HLAA、B、C单抗及抗CD158a单抗(即DX27，美国Pharmingen公司)[4]。均以5 μg/mL作用于相应细胞，37 ℃孵育2 h，以PBS洗去未结合抗体，然后再测定相应体外杀伤活性。

　　1.4 RTPCR检测CD158a分子mRNA表达 应用Trizol试剂法提取CD158a+ CTL细胞总RNA，RTPCR应用瑞士罗氏公司(Roche)生产的Titan RTPCR试剂盒。KIR引物的设计与合成参照文献[5]，委托上海生工公司合成。

　　KIR(402 bp)：

　　上游：5’TTCCCTCCTGGCCCACCCA3’

　　下游：5’TCCCTGGATAGATGGTACA3’

　　βactin(548 bp)：

　　上游：5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’

　　下游：5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTC3’

　　1.5 CD158a+ CTL与CD158a-CTL分泌γIFN及IL4的检测 采用Elispot试验[6], 略作修改。主要试剂均购自深圳晶美生物工程公司。抗 γIFN或抗人IL4单抗15 μg/mL包被96孔酶联检测板(Nunc)，4 ℃过夜;洗板，CD158a +CTL与CD158a-CTL以含10 mmol/L HEPES的RPMI 1640液配成1×106 mL-1，每孔加100 μL细胞悬液。加入自体DC(DC∶T为1∶10)100 μL[7]，加入自体抗原5 μg/mL，设不加抗原作对照，每一处理设三复孔，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养过夜;加入50 μL的生物素标记检测抗体(1 μg/mL)，孵育过夜;洗板，加入50 μL标记碱性磷酸酶的抗生物素蛋白(1.2 μg/mL),室温置2 h;洗板，每孔中加50 μL BCIP底物溶液(美国Sigma公司)。显色适当时间，检测γIFN需1 h，IL4约需5 h;洗板，倒置显微镜下，低倍镜观察孔底，计数全部紫色斑点，以每105细胞形成的斑点数表示产生细胞因子的细胞个数。

　　1.6 CD158a分子激发后诱导CTL凋亡观察

　　1.6.1 细胞处理 CD158a+ CTL与CD158a-CTL以RPMI 1640培养液洗涤，调整浓度为2×106 mL-1，种入细胞培养板(96孔，英国Greiner公司)。每孔100 μL，加入DX27抗体(AntiCD158a，美国Pharmingen公司)10 μg/mL;同浓度鼠抗人IgG2a作对照;不作处理组视为自发凋亡组。37 ℃下孵育2 h后，洗去游离抗体，以RPMI 1640液重悬细胞备用。

　　1.6.2 DNA琼脂糖凝胶电泳 取细胞2×106个，经裂解液(Tris HCl，pH 7.6)50 mmol/L、EDTA(pH 8.0)1 mmol/L、TritonX100 4 g/L充分混匀，4 ℃ 6 000 r/min离心20 min。沉淀经70%乙醇洗涤后溶于20 μL TE缓冲液。1.5%琼脂糖凝胶电泳(电泳参数5 V/cm)，电泳3 h，紫外灯下观察电泳条带。

　　1.6.3 AO/EB染色 将细胞配成3×106 mL-1，于25 μL悬液中加入1 μL口丫啶橙/溴乙啶染液(AO/EB，各含0.1 mg/mL),室温下染色15 min;在高倍荧光显微镜下(日本NIKON公司)计数活细胞和有异常染色质分布的细胞，AO着染经历凋亡的细胞的细胞核，EB着染死亡的细胞，活细胞不被染色;计数200个细胞,根据公式计算各组凋亡指数[8],每次计数由二位操作者独立进行，取均值。

　　1.6.4 凋亡细胞的AnnexinV/PI染色 用pH为7.0的Hepes/NaOH缓冲液(含140 mmol/L NaCl，25 mmol/L)0.1 mol/L将细胞配成1×106 mL-1，取细胞悬液0.1 mL加入5 μL AnnexinVPE(美国Pharmingen公司)，再加5 μL PI(50 μg/mL，英国Coulter公司)。室温、避光染色15 min;加400 μL结合缓冲液终止反应，1 h内FCM分析。AV+PI-为早期凋亡细胞，AV+PI+为后期凋亡的细胞或死细胞，AV-PI-为活细胞。

　　1.7 统计学处理 应用SPSS 13.0 统计软件分析，组间均数差异用t检验，率检验用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 胃癌患者T细胞CD158a表达 3例患者分离新鲜外周血T细胞表面均可检测出CD158a分子，表达范围为1%～10%，与健康人外周血比较，差别无统计学意义(P>0.05);而激活后的CTL细胞表达CD158a分子显著增多，与激活前T细胞表达率比较，差别有统计学意义(P<0.01，表1)。

　　2.2 CD158a+ CTL与CD158a- CTL体外杀瘤活性检测 CD158a+ CTL对胃癌MNK45几乎无杀伤活性，而CD158a- CTL表现了显著的细胞毒活性，两者比较差别具有统计学意义(P<0.001);但在阻断CD158a+ CTL表面KIR分子或者阻断MNK45细胞HLAI类分子后，CD158a+ CTL的体外杀瘤活性都得到一定程度恢复，说明CD158a分子削弱了CTL细胞毒作用(图1)。

　　2.3 CD158a分子 mRNA的RTPCR检测 3例患者CD158a+ CTL中均扩增出300 bp大小的条带，而CD158a-CTL中未能扩增出相应条带，荧光强度与CD158a表达率大小相一致(图2)。

　　2.4 CD158a+ CTL与CD158a- CTL分泌细胞因子检测 每例实验重复2次，取均值。表中所列数值为总斑点数扣除对照组(未加抗原)斑点数，代表105个细胞中分泌相应细胞因子频数。CD158a+ CTL以分泌IL4为主，反映Th2型免疫反应特征，而 CD158a-CTL则以分泌γIFN为特征，提示其介导了Th1型免疫反应(表2)。表2 CD158a+ CTL/CD158a- CTL分泌γIFN及IL4的检测

　　2.5 CD158a分子激发后诱导CTL凋亡研究

　　2.5.1 DNA琼脂糖凝胶电泳 P1、P3 CD158a+ CTL与DX27抗体孵育2 h后，DNA电泳表现出明显的梯形条带(“ladder”)改变，而对照(P1 CD158a+ CTL+对照IgG)则无“ladder”出现(图3)。

　　2.5.2 AO/EB染色 各组细胞凋亡指数见表3。3例患者CD158a+ CTL细胞表面KIR分子被相应抗体(DX27)激发后，均出现了显著的细胞凋亡变化，与同一患者来源的CD158a- CTL相比较，差别具有统计学意义(P<0.05)。表3 AO/EB染色计算凋亡指数

　　2.5.3 凋亡细胞的AnnexinV/PI染色 利用AnnexinV/PI染色法结合流式细胞仪方法检测，3例患者CD158+ CTL细胞自发凋亡率为0.9%(均值，下同)，与对照抗体孵育2 h后凋亡率为3.6%，而与相应DX27抗体作用后凋亡率为12.9%，与前者比较，差别具有统计学意义(P<0.05)，说明CD158a分子激发后可诱导早期细胞凋亡事件。

　　3 讨 论

　　Yamada等研究显示，健康个体外周血单个核细胞(PBMC)中的T细胞有4.6%～14.7%表达KIR分子[9]，本研究测定胃癌患者分离新鲜T细胞的表达值与之相近。然而，T细胞激活后CD158a表达显著增加，机制可能是：(1) T细胞激活后，只表达1种或2种T细胞受体(TCR)γ寡克隆扩增所致的非随机表达;(2) 持续抗原刺激可维持CD8+细胞表达KIR;(3) KIR+ T细胞在IL2存在条件下仍可扩增，导致在激活微环境中数量相对增加[10]。

　　CTL细胞表达KIR是机体免疫系统应答抗原时保持自稳性所必需的，通过表达KIR，KIR+ CTL获得了NK样活性，可识别正常机体细胞免遭CTL攻击，防止自身免疫反应发生。研究提示，在TCRα，β及TCRγ，δ型CTL中，P58分子或CD94分子均可显著抑制TCR激活介导的细胞毒效应[11]。KIR分子不仅抑制CTL细胞毒作用，也抑制T淋巴细胞分泌细胞因子。D，Andrea等研究表明，在以超抗原SEA诱导的KIR+ TCRαβ+ CTL中，KIR与HLAI配体结合抑制了TNFα与IFNγ因子的分泌;而在自身APC细胞呈递HLAI类分子为KIR+ T细胞所识别的状态时，以抗KIR单抗阻断又可促进上述二因子的分泌[5]。本研究采用Elispot方法显示，CD158a+ CTL与CD158a- CTL具有不同的细胞因子分泌特征，前者以IL4(Th2型)为主，后者以分泌γIFN(Th1型)为主。分析其机制：(1)KIR表达抑制T淋巴细胞分泌γIFN;(2)有资料表明，DC是异质性细胞群体，DC不同亚群导致T细胞向Th1/Th2分化[12]。(3)Pulendran等研究提示，DC分泌IL12促使Th0向Th1分化，而NK样T细胞，B细胞主要参与Th2免疫反应。KIR+ CTL通过表达KIR，获得了NK样活性。因此，KIR+ T细胞可调节机体免疫系统对外来抗原的应答反应，并在对机体维持免疫耐受过程中有重要意义。

　　但是KIR表达于CTL细胞对免疫应答有利有弊。体外杀伤MNK45活性实验表明，CD158a+ CTL对MNK45几乎无杀伤，而CD158a-CTL表现为高杀伤活性(P<0.001)。阻断靶细胞上MHCI分子或者阻断CTL细胞KIR分子，均可显著增强KIR+ CTL杀伤活性。利用表面质子共振技术，观察到KIR2DL3(P58.2分子构型)结合于HLAC抗原中的RYRPGTVAL特异性肽段[13]。这种杀伤抑制归因于KIR2D3L(P58.2分子)分子细胞质区具有2个免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)，待KIR与HLAI抗原结合后，ITIM中酪氨酸发生磷酸化，胞内酪氨酸磷酸化酶SHP2与ITIM结合阻止了早期激活信号转导，介导免疫细胞的抑制性信号。Guerra等研究揭示，CD158a分子阻断了肾癌CD8+CTL与肿瘤细胞接触时的TCR信号传递及膜空间构像重排[8]。

　　本研究观察到，以抗DX27抗体激发KIR+CTL表面KIR分子(P58.2)后, AO/EB染色可见淋巴细胞凋亡的形态学特征。DNA电泳可见典型的“ladder”条带。说明KIR激发后诱导了CTL细胞凋亡，而Annexin V/PI染色也表明有早期凋亡事件发生。Nakajima等也证实，以Dx9抗体可诱导表达NKB1(P70分子)的CTL细胞凋亡，并且该凋亡途径非Fas依赖性。机制在于KIR分子与相应配体结合后，ITIM基序中酪氨酸磷酸化，募集并活化了ITIM中的SHP1结构域，诱导了CTL凋亡。KIR+CTL凋亡的意义不明了，可能与机体维持正常免疫应答水平(防止自身免疫应答，保证CTL适度激活)有关。这种激活诱导凋亡(AICD)也是机体保持免疫稳态的重要环节。

　　本研究表明，KIR表达对CTL功能影响是多方面的，KIR为免疫细胞间相互作用及功能调节提供了精细的分子基础。KIR抑制CTL体外杀瘤活性、影响CTL分泌淋巴因子及诱导CTL细胞凋亡等研究丰富了对CTL功能(尤其是免疫识别与抑瘤作用)的认识。提示今后在设计细胞免疫治疗方案时，应充分考虑KIR分子表达因素。但是，KIR+ CTL在体内作用仍未明确，需作进一步探讨。

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